[发明专利]一种固相载体上酶法合成环肽方法

权利要求书

1.一种固相载体上酶法合成环肽的方法，其特征在于，是在合成多肽后利用酶在固相载体上直接将线性肽环化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶包括sortase A、butelase、蛋白酶、硫酯酶、异戊二烯基转移酶、谷氨酰胺转氨酶、omiligase或subtiligase。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)采用Fmoc-AA₁-树脂，溶胀后在去保护基溶液作用下脱除Fmoc；AA₁为多肽序列的第一个氨基酸；

(2)在活化剂和有机碱作用下，以DMF作为溶剂，氨基酸Fmoc-AAn-OH与树脂的第一个氨基酸进行缩合反应，反应1-3小时之后，去保护基溶液脱除Fmoc；其中，n≥2且n为整数；

(3)重复步骤(2)直至所有氨基酸偶联到树脂上，在切割试剂存在下脱去多肽侧链保护基；

(4)将所得负载多肽的树脂溶胀于酶反应缓冲液，利用酶进行线性肽环化生产环肽。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述树脂包括2-Cl树脂、MBHA树脂、PEGA树脂、Rinke amide树脂、TentaGel树脂、ArgoGel树脂、Wang三氯乙腈树脂、NovalGels树脂、SPOCC类树脂、PVA-PEG树脂、PAMAM树枝状树脂或HMAP树脂。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的树脂取代度为0.1-0.6mmol/g；脱除Fmoc的溶液为含体积分数10-25％哌啶的DMF。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的活化剂包括HATU、HBTU、TBTU、DIC、BOP、PyAOP、PyBOP、BOP或HOBT；有机碱包括N-甲基吗啉或N,N-二异丙基乙胺。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中形成二硫键的半胱氨酸侧链保护基为Trt、Acm、Meb和Mob中一种或者两种；所述氧化剂包括碘或DMSO。

8.根据权利要求1～7任一所述的方法，其特征在于，酶的作用方式包括以下任一种：

(1)srtA酶作用于C端为LPXTG以及N端为多聚甘氨酸的肽序列，其中X为除半胱氨酸以外的任何氨基酸；

(2)butelase酶作用于C端为NHV或DHV且N端为XI、XL、XV或XC的序列；其中，X为除P、D和E以外的任何氨基酸；

(3)蛋白酶的作用于YRH；

(4)谷氨酰胺转氨酶作用于N端为ALQ以及C端为K氨基酸的序列；

(5)subtiligase酶作用于N端为SY以及C端为FSKL的肽序列。

9.一种提高环肽合成效率的方法，其特征在于，在合成多肽后利用酶在固相载体上直接将线性肽环化；所述酶包括sortaseA、butelase、蛋白酶、硫酯酶、异戊二烯基转移酶、谷氨酰胺转氨酶、omiligase或subtiligase。

10.权利要求1～9任一所述方法在制备含有环肽的产品方面的应用。