[发明专利]一种提高酿酒酵母工程菌株发酵生产葡萄糖二酸的方法

说明书

本发明公开了一种提高酿酒酵母工程菌株发酵生产葡萄糖二酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过以在酿酒酵母基因组中多拷贝存在的Delta位点作为外源基因模块整合位点，实现外源基因模块一次整合达到多拷贝表达的目的。本发明通过整合表达的方式使经过整合基因组Delta位点后的基因工程菌，传代20次，在相同的发酵条件下葡萄糖二酸的产量仍为3.8g/L，对于葡萄糖二酸的工业化生产具有重要的应用意义。

技术领域

本发明涉及一种提高酿酒酵母工程菌株发酵生产葡萄糖二酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

D-葡糖二酸(D-glucaric acid)作为非常重要的有机酸已被广泛研究，其在医疗和工业中有着广泛的应用，比如降胆固醇、治疗糖尿病、肿瘤治疗等等[1,2]，或可能用作聚合物前体，包括新型尼龙和高度分支聚酯[2]。目前已经有利用产自葡萄糖的葡糖二酸制备羟基化尼龙的报道，羟基化尼龙是可生物降解的纤维[2]。在美国太平洋西北国家实验室、国家再生能源实验室和美国能源部写的一份报告中，葡糖二酸被认为是”top value-addedchemical from biomass”[3]。由于该有机酸的重要性，正越来越得到学术界和工业界的重视。

目前生产葡糖二酸的方法主要以化学法为主，即葡萄糖的化学氧化，采用硝酸作为溶剂和氧化剂，这是一个非选择性、高成本的过程。化学法的主要问题是低得率，只有不到40％；需要高温；会产生大量氧化反应副产物，不利于后续葡糖二酸的分离。虽然有研究发现催化剂五氧化二钒、4-乙酰氨基-2,2,6,6-四甲基-1-二苯哌酯等可以提高葡糖二酸的得率，但是这些催化剂太昂贵。生物法合成葡糖二酸相较于传统的化学法，有着很多的优势，比如更加环境友好，更大的实现低成本生产的可能性[1]。生物法产葡糖二酸有很多种途径[4]。在合适的菌种中构建高效稳定的葡糖二酸合成途径，应用于工业生产，取代传统的化学途径，将是非常有前景的研究领域。

麻省理工学院Prather课题组研究了大肠杆菌代谢工程产有机酸，其在大肠杆菌中构建了合成葡糖二酸的代谢途径，同时表达了三个酶，包括来自酿酒酵母的肌醇-1-磷酸合成酶Ino1(myo-inositol-1-phosphate)、单磷酸肌醇磷酸酶INM1(inositolmonophosphate 1-phosphatase)来自老鼠的肌醇磷酸氧化酶MIOX(myo-inositoloxygenase)和来自丁香假单胞菌的糖醛酸脱氢酶Udh，利用大肠杆菌现有的PTS途径(phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system)，合成葡糖二酸，从葡萄糖到葡糖二酸的代谢途径如图2所示[2]。最后经优化，最终葡糖二酸的产量为1g/L，MIOX是影响最终产量的最重要因素，是整合代谢流的限速步骤。主要原因是MIOX的不稳定性，在稳定期时，即使在没有葡糖二酸的情况下，MIOX的活力也会迅速下降。

该课题组利用蛋白融合技术提高了MIOX的稳定性，同时利用定向进化提高了MIOX的活力。将SUMO融合到MIOX的N-末端，使得葡糖二酸的产量提高了74％；虽然定向进化没有改进MIOX，但是他们筛选到了一个长941bp的DNA片段，它的表达可以提高肌醇的运输量，并且使得葡糖二酸的产量提高65％。最后，他们改造的重组大肠杆菌可以把10.8g/L的肌醇转化成4.85g/L的葡糖二酸[1]。该课题组还利用脚手架蛋白提高MIOX的比活力，从而提高了葡糖二酸的产量，相较于没有脚手架蛋白的对照，葡糖二酸产量提高了5倍。与之前报道的最高产量相比，提高了50％[5]。该课题组在大肠杆菌代谢工程制备葡糖二酸的研究中取得了突破。但由于在酿酒酵母中质粒表达的不稳定和易丢失，该类基因工程菌不适用于实际的工业化生产。

参考文献：