[发明专利]一种鲍鱼血细胞抗凝保护剂及其制备方法

说明书

本发明公开了一种鲍鱼血细胞抗凝保护剂及其制备方法，所述抗凝保护剂由以下成分组成：氯化钠2.45～2.55g、EDTA0.9～1.1g、1，4‑哌嗪二乙磺酸0.22～0.24g和0.1mM PBS 100ml。采用本发明的鲍鱼血细胞抗凝保护剂可保证鲍鱼血细胞在较长时间内不发生凝集且维持较高的存活率，解决了鲍鱼血细胞离体后短时间内凝集成团的问题，为研究鲍鱼非特异性免疫能力奠定基础。

技术领域

本发明涉及血细胞抗凝保护剂技术领域，具体涉及一种鲍鱼血细胞抗凝保护剂及其制备方法。

背景技术

鲍鱼由于营养丰富，经济价值高，成为我国重要的海水养殖品种。近年来，鲍鱼养殖遭受病害困扰，产量受到显著影响。针对鲍鱼非特异性免疫能力的研究成为解决鲍鱼病害问题的关键要素之一。鲍鱼主要通过血细胞对病原微生物的吞噬作用来实现基本的防御功能，因此对鲍血细胞的研究是探索非特异性免疫的重要环节。在不加抗凝保护剂的情况下，鲍鱼血细胞一旦离体，几分钟内即大量凝集。即便加入某些抗凝保护剂的鲍鱼血细胞在短时间内也会大量死亡，这个特点严重阻碍了我们对鲍鱼血细胞进行生化、免疫和分子生物学方面的研究。因此，开发在一定时间内可以防止鲍鱼血细胞凝集并保持细胞活性的抗凝保护剂是研究鲍鱼非特异性免疫能力的基础。

目前应用于鲍鱼血细胞的抗凝保护剂有灭菌海水、磷酸盐缓冲液(PBS)、Tris盐缓冲液(TBS)、哺乳动物血细胞的抗凝保护剂和其他贝类(牡蛎和扇贝)血细胞的抗凝保护剂等。应用效果上，灭菌海水、PBS和TBS并不适合，鲍鱼血细胞在短时间内就会发生大量凝集，并且血细胞的吞噬活性显著受到抑制。应用改良的哺乳动物血细胞保存液(modifiedAlserver’s solution，MAS)，即MAS抗凝保护剂，可以短暂保存疣鲍和牡蛎血细胞，但其抗凝效果并不清楚。应用牡蛎和扇贝抗凝保护剂可以得到不错的抗凝效果，但是抗凝时间不能持续很久。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鲍鱼血细胞抗凝保护剂，用以解决现有技术中鲍鱼血细胞离体后短时间内大量凝集的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鲍鱼血细胞抗凝保护剂，由以下成分组成：氯化钠2.45～2.55g、EDTA 0.9～1.1g、1，4-哌嗪二乙磺酸0.22～0.24g和0.1mM PBS 100ml。

优选地，所述抗凝保护剂由以下成分组成：氯化钠2.5g、EDTA 1g、1，4-哌嗪二乙磺酸0.23g和0.1mM PBS 100ml。

本发明还公开了上述鲍鱼血细胞抗凝保护剂的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)取0.1mM PBS缓冲液倒入烧杯中，再向烧杯中加入固体氯化钠粉末搅拌3-5分钟，直到氯化钠全部溶解，然后，加入1，4-哌嗪二乙磺酸粉末充分搅拌溶解得混合溶液A；

(2)然后将混合溶液A放入38-40℃水浴锅中加热，再缓慢加入EDTA，边加入边搅拌，直到EDTA完全溶解得混合溶液B；

(3)将混合溶液B转到室温状态下用磁力搅拌器搅拌0.5-1h，使各组分充分溶解到PBS缓冲液中；

(4)超净工作台开启紫外杀菌功能30-35min，然后在超净工作台上将混合溶液B先用0.45um无菌滤器过滤除杂放入灭菌蓝盖瓶中，再用0.22um无菌滤器将蓝盖瓶中液体过滤除菌，然后得到的鲍鱼血细胞抗凝保护剂(记为AP)。

优选地，上述鲍鱼血细胞抗凝保护剂的制备方法中，所述步骤(2)中水浴锅加热温度为40℃。

优选地，上述鲍鱼血细胞抗凝保护剂的制备方法中，所述步骤(3)中磁力搅拌器搅拌时间为0.5h。

上述鲍鱼血细胞抗凝保护剂可在4℃或室温条件下，保存于灭菌蓝盖瓶中备用。

本发明方法具有如下优点：