[发明专利]转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制及应用

权利要求书

1.一种转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制，其特征在于，包括：

(1)重金属超富集基因的克隆

克隆水稻中OsNramp5基因；

(2)超量表达双元载体的构建

以植物表达载体为基础，构建包含强启动子、筛选基因的转化载体，将骤(1)克隆得到的OsNramp5基因通过同源重组方法插入所述转化载体，获得超量表达双元载体；

(3)重金属超富集转基因植株构建

将步骤(2)所得的超量表达双元载体通过根癌农杆菌转入水稻愈伤组织中，用筛选培养基进行筛选培养，获得的转基因抗性水稻愈伤组织经过诱导、分化、生根、转基因苗的锻炼和移栽，筛选重金属超富集转基因阳性植株；

其中，所述OsNramp5基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述转基因工程水稻品种为日本晴。

2.如权利要求1所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制，其特征在于，所述步骤(1)中，克隆水稻中OsNramp5基因的方法为：

以水稻的cDNA为模板，以如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的序列为引物对进行PCR扩增，得到OsNramp5基因。

3.如权利要求1所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制，其特征在于，所述植物表达载体为pCAMBIA1301载体，所述强启动子为Ubiquitin启动子，所述筛选基因为Bar筛选基因，所述转化载体还包括3×Flag标签。

4.如权利要求3所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制，其特征在于，所述转化载体的构建方法包括以下步骤：

(a)在所述pCAMBIA1301载体多克隆位点Kpn I和Sac I之间添加所述3×Flag标签；

(b)采用PCR扩增反应克隆所述pCAMBIA3301载体上的所述Bar筛选基因；

(c)使用内切酶Xho I酶切步骤(a)中获得的载体，并将所述Bar筛选基因与酶切后的载体进行同源重组；

(d)采用Hind III和BamH I酶切pUN1301载体上的Ubiquitin启动子；

(e)使用内切酶Hind III和BamH I酶切步骤(c)中获得的重组载体，并将所述Ubiquitin启动子与酶切后的重组载体连接。

5.如权利要求4所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制，其特征在于，所述Ubiquitin启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述Bar筛选基因核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述3×Flag标签的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

6.如权利要求4所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制，其特征在于，步骤(b)中，所述克隆pCAMBIA3301载体上的所述Bar筛选基因的PCR引物序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示。

7.如权利要求3所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制，其特征在于，所述筛选培养基包含草铵膦。

8.如权利要求1所述的转日本晴水稻OsNramp5基因的重金属超富集转基因工程水稻的创制，其特征在于，所述植物表达载体为pCAMBIA1301载体，所述强启动子为2×CaMV35S启动子，所述筛选基因为HYG筛选基因。