[发明专利]一种葡萄snRNA U6 基因及其引物和应用

说明书

本发明公开了一种葡萄snRNA U6基因及其引物和应用，本发明首次鉴定得到了葡萄snRNA U6基因，并设计了该基因用于实时荧光定量PCR的引物。实验证明，该基因及引物可以用于葡萄基因及葡萄miRNA的实时荧光定量PCR分析，该葡萄snRNA U6基因在葡萄各个组织及冷胁迫条件下表达量稳定，可靠性较好。本发明snRNA U6基因可以作为实时荧光定量PCR的内参基因，U6基因是目前公认的最适合用于作为miRNA荧光定量的内参基因，以snRNA U6为内参做出的表达结果与miRNA测序表达谱高度吻合，有利于少量miRNA的表达分析，操作相对简单，成本较低，灵敏度高。

技术领域

本发明涉及一种葡萄snRNA U6 基因、进行实时荧光定量PCR扩增该基因的引物以及该基因作为葡萄miRNA定量PCR检测的内参基因的应用。

背景技术

miRNA（MicroRNA) 是一类在生物界中广泛存在的小分子非编码单链RNA，长约21～24nt，它能通过降解或抑制互补的靶mRNA来进行转录后基因表达调控，并且在生物的各个发育时期和不同的组织器官中广泛表达，参与到生物的各种生理活动中，因其在生物中的重要性，近几年国内外科学家对miRNA 的研究倍加重视。对葡萄miRNA 的研究有助于推动葡萄种植业的发展。葡萄中只报导了187 条miRNA，对miRNA的定量研究的较少。

目前对miRNA的表达分析主要有高通量测序，基因芯片和实时荧光定量PCR法三种。其中，高通量测序和基因芯片法为高通量监测的方法，成本很高，不适于少量miRNA 的功能分析，并且需要利用实时荧光定量PCR方法来验证。而基于SYBR Green 染料荧光定量PCR 的miRNA 相对定量法表达分析有着操作相对简单，成本较低，灵敏度高的优势，广受研究人员的欢迎。在相对定量中，内参的选择尤为重要。目前内参的选择大多数采用一些表达相对恒定的管家基因，如snRNA U6，5S rRNA 等。U6 基因是一种核剪切子RNA，参与到pre-mRNA的加工剪切，它的序列比较保守，在不同的物种中同源性高，相比较其他内参基因，snRNA U6更普遍的作为miRNA定量分析的内参基因。但是葡萄snRNA U6基因序列和引物尚未有相关报道，更没有以葡萄U6 基因作为内参基因来对葡萄miRNA进行定量的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供葡萄snRNA U6 基因和扩增该snRNA U6基因的引物，本发明通过研究首次得到葡萄snRNA U6 基因并提供了扩增该基因的引物，该引物能准确的特异性的扩增出葡萄snRNA U6 基因，该基因在葡萄各个组织、冷胁迫诱导下的表达均很稳定，为葡萄miRNA 定量PCR检测提供了可用的内参。

本发明的另一目的是提供该葡萄snRNA U6 基因作为葡萄miRNA 的定量PCR检测的内参基因的应用，还提供了采用实时荧光定量PCR检测葡萄miRNA的方法。该方法采用本发明snRNA U6基因为内参，所得表达结果与miRNA组高通量测序表达谱高度吻合，准确率高。

葡萄snRNA U6基因属于一种非编码的小RNA，在目前公布的葡萄基因组中没有关于非编码小RNA的信息。虽然U6基因在各个物种中有一定的保守性，但不同物种的U6基因还是存在其本身的特异性，要对葡萄的miRNA 进行实时荧光定量PCR检测，必须使用葡萄的U6基因作为内参才可以，采用其他物种的U6基因不可行，存在准确率无法保障的问题。并且，不同物种的U6基因序列之间虽然相似度较大，但是即使一个碱基的差别也会影响引物设计的精确性，只有针对具体的基因序列设计出的特定引物才能实现对序列的准确扩增，不同物种U6基因的引物也无法通用。发明人通过小RNA组高通量测序、同源克隆结合的方法从葡萄中首次鉴定得到了葡萄snRNA U6基因，并设计了该基因的PCR引物，可以方便快捷的扩增出该基因，为其作为内参基因提供了技术支持。

本发明具体技术方案如下：