[发明专利]一种饱和脂肪酸特异性脂肪酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种饱和脂肪酸特异性脂肪酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。本发明根据华根霉脂肪酶(RCL)结构分析，对其进行定点突变，获得了脂肪酸特异性改变的突变酶。比较野生型脂肪酶与突变酶催化水解动物油的能力，得到了水解率远高于野生型脂肪酶的突变酶。相比野生型RCL，突变酶T286Q、I281F和A116W/I281F由于增强了对饱和脂肪酸的特异性，其对猪油水解率分别由55％提高到了85％、90％和86％。

技术领域

本发明涉及一种饱和脂肪酸特异性脂肪酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

脂肪酸是油脂化工中最基础，使用最为广泛的原料之一。天然油脂水解是获得游离脂肪酸的重要途径之一。脂肪酸的生产技术主要有皂化法、水解法、蒸汽裂解法以及酶水解法，其中酶水解法由于具有反应条件温和、不饱和脂肪酸不易被氧化、副产物少的优势，成为脂肪酸制取方法的研究热点。不同类型、不同碳链长度及不同比例的脂肪酸具有不同的功能。短链脂肪酸可作为饲料添加剂，促进动物生长。中链脂肪酸广泛应用于医药、保健食用油及养殖业。长链不饱和脂肪酸在代谢中具有广泛的生理活性，用于健康保健。植物油脂中不饱和脂肪酸含量较高，如大豆油、菜籽油和油茶油中不饱和脂肪酸含量分别为84.34％、77.70％和81.43％。长链饱和脂肪酸如棕榈酸和硬脂酸，广泛存在于猪、牛和羊等动物油中，主要用于生产作为乳化剂的脂肪酸盐，并作为常用的塑料制品的稳定剂。动物油中各类饱和脂肪酸质量分数之和通常在60％以上，而且脂肪酸链长多为十六碳、十八碳，合计可达90％以上，含有十六个及十八个碳原子的脂肪酸经甲酯化后得到的甲酯产品与矿石柴油具有相近的碳原子数，同时在很多理化性质上都有相似性，因此可以利用动物油水解制备脂肪酸作为生物柴油的合成原料。

脂肪酶(Triacylglycerol hydrolase，Lipase，EC 3.1.1.3)是一类甘油三酯水解酶，在油水界面催化酯键的水解或者合成，是“绿色”油脂加工制造的重要工业酶。动物油是制备长链饱和脂肪酸的重要来源，但脂肪酶对其的水解率不高，仅为60％左右(饲料工业杂志2008第 12期P8-11)。其可能的原因是在于脂肪酶对饱和脂肪酸的底物特异性无法满足油脂加工行业的需求，若能够进一步提高脂肪酶对饱和脂肪酸的特异性，可以预期提高对动物油脂的水解效率。

发明内容

为解决上述问题，本发明通过理性设计华根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶(RCL)突变位点，获得了饱和脂肪酸特异性提高的突变酶，并且提高了对动物油的水解率。

本发明的第一个目的是提供一种脂肪酶突变体，所述脂肪酶突变体相对于具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的脂肪酶，包括脂肪酶底物结合口袋的一个、两个或三个氨基酸残基的变化；所述变化增加口袋空间位阻；所述变化与脂肪酶对饱和脂肪酸的特异性相关。

在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶突变体是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列的基础上，将第286位的苏氨酸突变为谷氨酰胺，或者将第281位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸，或者将第116位的丙氨酸突变为色氨酸的同时将第281位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，第286位的苏氨酸突变为谷氨酰胺得到突变体T286Q；第 281位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸得到的突变体为I281F；将第116位的丙氨酸突变为色氨酸的同时将第281位的异亮氨酸突变为苯丙氨酸得到的突变体为A116W/I281F。

本发明的第二个目的是提供编码所述脂肪酶突变体的基因序列。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因序列的质粒或细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞为细菌、真菌或古菌。