[发明专利]一种检测肿瘤单细胞体细胞突变的方法

说明书

本发明公布了一种检测肿瘤单细胞体细胞突变的方法。该方法结合肿瘤单细胞的群体多态性位点信息以及基因组拷贝数变化信息分析，充分考虑到单细胞扩增技术可能引入的随机碱基替换及相应基因组扩增和测序技术可能引入的系统性偏差，提高了体细胞突变检测的准确率，对肿瘤基因组的异质性描述以及肿瘤基因组演化信息有着重要的意义。

技术领域

本发明涉及单细胞基因组测序、肿瘤基因组分析、单细胞突变分析和生物信息学领域，具体涉及一种检测肿瘤单细胞基因组单倍体拷贝数变异分析基因组异质性及细胞间演化关系方法。

背景技术

基因组测序技术已经被广泛应用于生命科学的基础研究以及相应的一些转化科学应用领域。目前，以solexa测序技术为主的二代短序列测序技术更展示出了它广泛的适用范围和巨大的应用前景。基于目的不同我们能够对DNA进行直接测序，从而组装新物种或者检测已有参考序列的物种基因组的改变，例如：单核苷酸多态性位点(SNP，singlenucleotide polymorphism)，短序列插入或者缺失(INDEL，insertion and deletion)，基因组结构变异(SV，structural variation)以及基因组拷贝数变化(CNV，copy numbervariation)。

癌症是一种基因组疾病。在癌症基因组研究中，我们通常会对比癌组织和正常组织之间基因组差异来探究与癌症发生、发展、迁移以及耐药有关的基因组变化，包括体细胞单核苷酸变异(sSNV)，体细胞短序列插入或者缺失(sINDEL)，体细胞基因组结构变异(sSV)以及体细胞基因组拷贝数改变(sCNA,somatic copy number alteration)。随着癌症研究的逐步深入，对于这种异质性极强的疾病，我们发现利用大量细胞(bulk)测序的技术手段无法直观地探究癌细胞异质性发生的原因。另一方面，在临床医学研究中我们经常无法获取足够量的癌细胞以获取足够量的用来测序的DNA进行研究。因此，单细胞扩增技术被引入到癌症基因组研究中。

单细胞扩增技术旨在将仅有数皮克的微量DNA通过相应的技术手段扩增到二代测序技术所需要的最低纳克水平，以达到精确地研究每个细胞中的基因组状态。目前较为广泛使用的单细胞扩增技术包含但不限于：扩增前引物延伸PCR(PEP-PCR，Primer extensionpreamplification PCR)、退变寡核苷酸引物PCR(Degenerate oligonucleotide primer-PCR,DOP-PCR)、多重置换扩增(MALBAC，Multipe Annealing and Looping BasedAmplification Cycles)等。而无论何种单细胞扩增技术都会存在一定的等位基因丢失(ADO，Allele Drop Out)比率、等位基因扩增比例偏差、区域扩增偏好性、碱基扩增随机性及系统性错误，都对单细胞基因组分析形成了很强的限制。

在肿瘤发生发展过程中会存在广泛的异质性，而这种异质性在sSNV/sINDEL层面已经得到广泛且深入的研究。在常规大量组织测序结果中，这种异质性反映在同一病人不同样本之间特定体细胞突变的突变频率差异上。使用单细胞测序技术就可以明确地得到每个单细胞中的突变构成。但是，单细胞扩增及测序过程引入的大量随机及系统性误差严重影响到了肿瘤单细胞体细胞突变检测工作。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术缺口，提供一种对肿瘤单细胞体细胞突变检测的方法。该方法充分考虑到单细胞扩增技术可能引入的随机碱基替换及相应基因组扩增和测序技术可能引入的系统性偏差，提高体细胞突变检测的准确率，对肿瘤基因组的异质性描述以及肿瘤基因组演化信息有着重要的意义。

本发明的技术方案如下：

一种检测肿瘤单细胞体细胞突变的方法，包括以下步骤：

1)取同一病例的至少四个肿瘤单细胞，并以该病例的至少一个正常组织单细胞和正常组织大量细胞为对照样本，同时进行全基因组或者全外显子高深度测序，其中单细胞样本需要进行单细胞扩增后再测序；