[发明专利]一种单克隆抗体结合单精子冷冻载体及冷冻解冻方法

权利要求书

1.一种单克隆抗体结合单精子冷冻载体的冷冻解冻方法，所述的单克隆抗体具有抗原结合位点为精子表现锚定蛋白；在精子转化成熟、获能过程中不脱离精子表面；抗原抗体结合稳定，抗原抗体结合力可稳定吸附精子；精浆内无该单克隆抗体的抗原存在；单克隆抗体和精子的结合方式是单克隆抗体结合位点与该抗原决定簇特异性结合形成抗原抗体复合体，对抗原形成一定的吸附力，单克隆抗体与精子的体积比例为(10～1000)：1，形成抗体精子溶液，其特征在于按照以下步骤进行：

(1)玻片处理：将玻片逐片加入到piranha溶液中用浸泡15-240min，然后再放入纯水中超声，至少换水三次以去除玻片表面的有机物，玻片放在80-150℃干燥箱中干燥15-240min，备用；

(2)将3-氨丙基三乙氧基硅烷溶到无水乙醇中，其质量比为1％-10％，将上述干燥的玻片浸到3-氨丙基三乙氧基硅烷溶到无水乙醇中的液体中浸泡12-72小时；此过程将玻片表面进行的基团-OH转换成-NH3；

(3)将玻片用无水乙醇冲洗1-5次后，浸泡在5％戊二醛水溶液中1小时，浸泡结束后用大量的超纯水冲洗；

(4)将处理的玻片浸泡在浓度为0.5-0.001mg/ml，温度为35℃-40℃的精子抗体溶液中10min-24h；

(5)用显微受精针取单个或多个精子，添加在玻片表面滴加的精子冷冻保护剂中，固定5-240min；

(6)将玻片装入冷冻试管中，置于液氮平面上1-10cm；1-120min后，置于液氮内冷冻；

(7)解冻：在冷冻试管中取出载体玻片，迅速插入用操作皿盛放的已经平衡至35℃-40℃的矿物油中，一起置35℃-40℃培养箱中复温5-240min。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体结合单精子冷冻载体的冷冻解冻方法，其特征在于所述的步骤(1)中玻片逐片加入到piranha溶液中用浸泡15min，然后再放入纯水中超声，至少换水三次以去除玻片表面的有机物，玻片放在105℃干燥箱中干燥30min，备用。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体结合单精子冷冻载体的冷冻解冻方法，其特征在于所述的步骤(2)中将3-氨丙基三乙氧基硅烷溶到无水乙醇中，其质量比为2.5％，将上述干燥的玻片浸到3-氨丙基三乙氧基硅烷溶到无水乙醇中的液体中浸泡24小时。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体结合单精子冷冻载体的冷冻解冻方法，其特征在于所述的步骤(3)中将玻片用无水乙醇冲洗3次后，浸泡在5％戊二醛水溶液中1小时，浸泡结束后用大量的超纯水冲洗。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体结合单精子冷冻载体的冷冻解冻方法，其特征在于所述的步骤(4)中将处理的玻片浸泡在浓度为0.1mg/ml，温度为37℃的精子抗体溶液中1小时。

6.根据权利要求1所述的单克隆抗体结合单精子冷冻载体的冷冻解冻方法，其特征在于所述的步骤(5)中用显微受精针取单个或多个精子，添加在玻片表面滴加的精子冷冻保护剂中，固定10min。

7.根据权利要求1所述的单克隆抗体结合单精子冷冻载体的冷冻解冻方法，其特征在于所述的步骤(6)中将玻片装入冷冻试管中，置于液氮平面上2cm；5min后，置于液氮内冷冻。

8.根据权利要求1所述的单克隆抗体结合单精子冷冻载体的冷冻解冻方法，其特征在于所述的步骤(7)中在冷冻试管中取出载体玻片，迅速插入用操作皿盛放的已经平衡至37℃的矿物油中，一起置37℃培养箱中复温10min。