[发明专利]一种用于检测松材线虫的等温扩增试剂盒及其检测方法

说明书

本发明提出一种用于检测松材线虫的等温扩增试剂盒及其检测方法，属于松材线虫检测领域，能在一个小时内完成松材线虫核酸的提取、扩增、显色检测，在检测到单条松材线虫的同时有效区分松材线虫和拟松材线虫。该用于检测松材线虫的等温扩增试剂盒包括SEA扩增引物、2×SEA reaction Mix和10×SEA比色染料，其中，所述SEA扩增引物包括如SEQ ID No.1所示的上游引物和如SEQ ID No.2所示的下游引物。本发明能够应用于松材线虫的快速检测中。

技术领域

本发明属于松材线虫的检测领域，尤其涉及一种用于检测松材线虫的等温扩增试剂盒及其检测方法。

背景技术

松材线虫(Bursaphe lenchus xylophilus)引起的松树萎蔫病是松林主要的病害之一，1982年，松材线虫病传入我国，仅短短的30多年，疫区范围扩大到江苏、浙江、安徽、福建、江西、山东、湖北、湖南、广东、广西、四川、重庆、贵州、云南等17个省区市，造成经济损失上千亿元，严重威胁着我国松林生态系统和经济财产安全，因此，建立一种灵敏、快速、简便的松材线虫检测方法对松材线虫的防治极为重要。

因病原体松材线虫与低致病性的拟松材线虫及其近缘种之间在形态学上很难区分，用形态学方法上容易造成误判、漏判，所以形态学鉴定的方法逐渐被淘汰。近年来，随着分子生物学的发展，特异性引物PCR、实时荧光定量PCR等分子诊断方法被应用到松材线虫的检测上，提高了松材线虫检测的准确性。但依然存在很多缺点，如耗时长、操作繁琐、需要昂贵的热循环仪器，而且很多需要开盖检测容易造成污染，需要在专门的实验室中操作。因此建立一种快速、简单、无污染，可快速检测线虫的技术意义重大。

发明内容

本发明提出一种用于检测松材线虫的等温扩增试剂盒及其检测方法，该等温扩增试剂盒具有灵敏度高、特异性好、操作简单、耗时短等特点，能够在一个小时内完成松材线虫核酸的提取、扩增、显色等检测，为松材线虫的快速检测提供一种实际可行的方法。

为了解决上述技术问题，本发明的一方面提供了一种用于检测松材线虫的等温扩增试剂盒，包括SEA扩增引物、2×SEA reaction Mix和10×SEA比色染料，其中，所述SEA扩增引物包括如SEQ ID No.1所示的上游引物和如SEQ ID No.2所示的下游引物。

本发明的另一方面提供了一种检测松材线虫的方法，包括以下步骤：

1)采用热裂解法从待检测样品中提取松材线虫基因组DNA；

2)以提取的含有松材线虫基因组DNA的裂解液作为扩增模板，加入如权利要求1所述的等温扩增试剂盒中的组分建立SEA反应体系并进行等温扩增；

3)根据扩增产物的颜色变化，判断待检测样品中是否存在松材线虫。

作为优选，步骤1)具体为：

取松材线虫悬浮液4.5μl加入到0.5ml的Eppendorf管中，然后加入5μl 2×-8×标准浓度WLB液,并向管中加入0.5μl的20×液相RNase去除剂，最后在80-99℃处理2-20min，得到松材线虫的裂解液作为扩增模板。

作为优选，步骤1)具体为：

取松材线虫悬浮液4.5μl加入到0.5ml的Eppendorf管中，然后加入5μl WLB液,并向管中加入0.5μl的20×液相RNase去除剂，最后在95℃处理5min，得到松材线虫的裂解液作为扩增模板。

作为优选，所述SEA反应体系以恒定62-66℃的温度反应40-60分钟。

作为优选，所述SEA反应体系以恒定63℃的温度反应50分钟。