[发明专利]稳定表达人内源性INav的细胞模型及其制备方法和用途

说明书

本发明提供了一种稳定表达人内源性INav的细胞模型，采用一个宿主细胞，宿主细胞中含有dCas9‑VP64融合蛋白和SCN5A的引导RNA；dCas9‑VP64融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示，SCN5A的引导RNA的序列如SEQ ID NO.2所示。还提供了上述细胞模型的制备方法，将dCas9‑VP64融合蛋白和SCN5A‑gRNA分别构建到载体上，然后分别包装成病毒，将上述的病毒感染宿主细胞，最后筛选阳性克隆，即得稳定表达人内源性INav的细胞模型。本发明在SCN5A启动子区域转录激活内源性人SCN5A基因，增加其表达，发挥通道功能，为进行体外药物高通量筛选带来了许多便利。

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种细胞模型，具体来说是一种稳定表达人内源性INav的细胞模型及其建立方法与应用。

背景技术

离子通道是细胞膜上的孔道蛋白，是细胞生物电的基础。钠离子通道广泛存在于可兴奋细胞中，维持细胞的兴奋性和正常生理功能。电压依赖性的钠通道(INav)主要存在于心房肌、心室肌和希浦系统的细胞膜上，参与动作电位0相去极化及2相平台期，决定细胞的兴奋性和传导性。SCN5A基因编码INav通道的α亚基，其基因突变会引起INav功能异常，是引起多种恶性心律失常的重要原因，也是开发治疗心律失常药物的靶点，因此深入研究INav通道特性、药理特性及其调节机制将可能为此类心律失常的防治提供新线索。

电生理方法筛选阳性的离子通道克隆以及进行药物筛选，是检测离子通道是否在细胞表面表达且发挥功能的标准方法。利用膜片钳技术记录透过离子通道的离子电流来反映细胞膜上离子通道的分子活动，能够很好的研究细胞表面离子通道的作用，广泛应用于药物化合物的筛选。HEK293细胞是来源于人胚肾细胞的细胞系，其转染效率高，胞体大，广泛应用于细胞电生理的研究。

目前利用人源性细胞进行药物的高通量筛选存在以下问题：1)人的组织样本来源困难、个体差异大；2)外源离子通道基因稳转到人源细胞系中，缺乏通道基因的可变剪切形式，可能与内源性基因的调控方式不一致；3)形成的通道电流变异度高，无法进行高通量筛选。因此，需要建立体外稳定表达的人内源性细胞模型，助力药物的稳定高效筛选。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种稳定表达人内源性INav的细胞模型及其建立方法与应用，所述的这种稳定表达人内源性INav的细胞模型及其建立方法与应用要解决现有技术中的人源性细胞无法进行药物的高通量筛选的技术问题。

本发明提供了一种稳定表达人内源性INav的细胞模型，采用一个宿主细胞，所述的宿主细胞中含有dCas9-VP64融合蛋白和SCN5A的引导RNA；所述的dCas9-VP64融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示，所述的SCN5A的引导RNA的序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，所述的宿主细胞为HEK293细胞。

本发明还提供了一种稳定表达人内源性INav的细胞模型的制备方法，将dCas9-VP64融合蛋白和SCN5A-gRNA分别构建到载体上，然后分别包装成病毒，将上述的病毒感染宿主细胞，最后筛选阳性克隆，即得稳定表达人内源性INav的细胞模型。

进一步的，将dCas9-VP64融合蛋白构建到pLVX-Puro载体上，获得pLVX-dCas9-VP64-Puro载体，将SCN5A-gRNA构建到pLVX-shRNA2载体上，获得pLVX-SCN5A-gRNA-Zsgreen1载体，用三质粒包装系统将pLVX-dCas9-VP64-Puro与psPAX2和pMD2.G三个质粒共转包装成病毒，用三质粒包装系统将pLVX-SCN5A-gRNA-Zsgreen1与psPAX2和pMD2.G三个质粒共转包装成病毒，将上述的两个病毒同时感染宿主细胞，最后筛选阳性克隆，即得稳定表达人内源性INav的细胞模型。进一步的，所述的一种稳定表达人内源性INav的细胞模型的制备方法包括：