[发明专利]一种人脂肪干细胞的分离与培养方法有效
申请号: | 201810102159.2 | 申请日: | 2018-02-01 |
公开(公告)号: | CN108220230B | 公开(公告)日: | 2022-01-18 |
发明(设计)人: | 李文荣;李新峰;周雁冰 | 申请(专利权)人: | 上海莱馥医疗科技有限公司 |
主分类号: | C12N5/0775 | 分类号: | C12N5/0775 |
代理公司: | 上海元好知识产权代理有限公司 31323 | 代理人: | 贾慧琴 |
地址: | 201114 上海市闵*** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 脂肪 干细胞 分离 培养 方法 | ||
1.一种人脂肪干细胞的分离与培养方法,其特征在于,其包括以下步骤:
步骤1:采用Liberase消化酶溶液消化脂肪抽吸物,消化结束后中和消化酶,离心、过滤,然后用淋巴细胞分离液进一步去除杂细胞后得到人脂肪干细胞;
步骤2:采用无血清培养基培养步骤1所得到的人脂肪干细胞,其中,无血清培养基添加以下组分:
终浓度为10~50 ng/ml的重组人表皮生长因子;
终浓度为10~50 ng/ml的重组人碱性成纤维细胞生长因子;
终浓度为1~50 ng/ml的重组人转化生长因子-β;
终浓度为10~50 ng/ml的重组人血小板衍生生长因子-BB;
终浓度为1~100 ng/ml的重组人干细胞因子;
终浓度为1~5 mM的还原型谷胱甘肽;
终浓度为1~50 µg/ml的辅酶A;
终浓度为1~50 µg/ml的生物素;
终浓度为1~100 µg/ml的庆大霉素,及,
以下组分:终浓度为1x的MEM维生素溶液;终浓度为1x的MEM氨基酸溶液;终浓度为1x的MEM非必需氨基酸溶液;终浓度为1x的GlutaMAX添加剂;终浓度为1x的胰岛素-转铁蛋白-硒溶液;
步骤2中,人脂肪干细胞第一次用1~10 µg/mL的重组人纤连蛋白和1~10 µg/mL的透明质酸包被过的培养瓶培养,以后只使用被1~10 µg/mL的重组人纤连蛋白包被过的培养瓶培养。
2.如权利要求1所述的人脂肪干细胞的分离与培养方法,其特征在于,步骤1中,Liberase消化酶溶液使用无血清培养基配制。
3.如权利要求1所述的人脂肪干细胞的分离与培养方法,其特征在于,步骤1中,消化酶溶液与脂肪抽吸物的体积比为1:1。
4.如权利要求1所述的人脂肪干细胞的分离与培养方法,其特征在于,步骤1中,消化温度为37℃,消化时间为10-30分钟。
5.如权利要求1所述的人脂肪干细胞的分离与培养方法,其特征在于,步骤1中,采用等体积的含有10% FBS的无血清培养基中和消化酶。
6.如权利要求1所述的人脂肪干细胞的分离与培养方法,其特征在于,步骤1中,过滤具体为先后用直径100微米和40微米的过滤网过滤。
7.如权利要求1所述的人脂肪干细胞的分离与培养方法,其特征在于,所述培养瓶在4℃的条件下包被过夜。
8.如权利要求1所述的人脂肪干细胞的分离与培养方法,其特征在于,步骤2中,无血清培养基为DMEM-F12。
9.如权利要求1所述的人脂肪干细胞的分离与培养方法,其特征在于,步骤2中,人脂肪干细胞的传代过程使用TrypLETMSelect消化细胞。
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