[发明专利]基于Argonaute蛋白的荧光原位杂交方法及应用

权利要求书

1.一种基于Argonaute蛋白的荧光原位杂交方法，其特征在于，利用失去酶切活性但保留单链DNA结合活性的Argonaute蛋白突变体，对其进行荧光标记并结合5’端磷酸化的单链导向DNA作为探针，将荧光标记带到与单链导向DNA互补配对的原位DNA序列上，从而实现对染色体上任意片段的原位荧光标记，其中所述Argonaute蛋白突变体是通过突变来源于嗜热栖热菌Thermus thermophilus的Argonaute蛋白的氨基酸残基Asp478、Glu512、Asp546和Asp660中的一个或多个，得到的失去酶切活性但保留单链DNA结合活性的蛋白突变体dTtAgo。

2.如权利要求1所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，所述单链导向DNA的长度为13～77nt。

3.如权利要求1所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，对所述Argonaute蛋白突变体进行荧光标记的方法选自下列方法中的一种或多种：荧光蛋白标记、SNAP-tag标记、HaloTag标记和用荧光染料直接标记。

4.如权利要求1～3中任一所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，所述荧光原位杂交方法包括以下步骤：

1)对细胞样品进行固定，透膜处理，去蛋白处理，RNA降解，预变性和变性处理；

2)将荧光标记的Argonaute蛋白突变体与5’端磷酸化的单链导向DNA结合，获得探针；

3)将变性处理后的细胞样品与探针进行杂交；

4)将杂交后的样品进行杂交液洗脱，得到目标基因组位点被荧光标记的样品。

5.如权利要求4所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，上述步骤1)中，利用甲醇乙酸溶液对细胞样品进行固定；然后用体积百分含量为20％的甘油溶液处理细胞样品，之后将细胞样品在液氮中反复冻融多次进行透膜处理；接着采用盐酸溶液对细胞样品进行去蛋白处理；采用RNA酶A在37℃条件下处理细胞样品，除去细胞中的RNA分子；在含有50％的甲酰胺、0.1％的吐温20和2×SSC的变性液中室温下放置5分钟后，在47℃孵育20分钟进行预变性，然后在78℃下孵育10分钟进行变性处理。

6.如权利要求4所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，步骤2)将荧光标记的Argonaute蛋白突变体与5’端磷酸化的单链导向DNA在缓冲液中混合，制备得到探针。

7.如权利要求4所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，步骤3)在47±5℃温度范围内将细胞样品和探针在杂交液中孵育，所述杂交液中不含有甲酰胺，也不含有硫酸葡聚糖。

8.如权利要求7所述的荧光原位杂交方法，其特征在于，所述杂交液含有：20-50mMTris-盐酸，pH 6.0-9.0，200-500mM NaCl，100μM-1mM MgCl₂，1-5wt％牛血清蛋白，10μg/mL-1mg/mL鲑鱼精子DNA，5-50v％甘油，0.1-1v％吐温20，1-10mM二硫苏糖醇。