[发明专利]一种检测碱性磷酸酶的液晶生物传感器及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种检测碱性磷酸酶的液晶生物传感器，其特征在于：包括液晶敏感膜、滴加在所述液晶敏感膜上的5CB液晶分子和DMOAP修饰的上玻片，所述液晶敏感膜为先经过硅烷化修饰，再利用戊二醛将纳米金修饰到玻片表面制备得到，利用沉积到液晶敏感膜表面的银纳米颗粒对5-CB液晶分子产生扰乱来实现对碱性磷酸酶的检测。

2.一种液晶生物传感器的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤（1）、制备谷胱甘肽为配体的纳米金；

步骤（2）、玻片的洁净；

步骤（3）、DMOAP修饰的上玻片和氨基修饰的下玻片的制备；

步骤（4）、液晶敏感膜的制备

将步骤（3）的下玻片浸入浓度为0.5-1%的戊二醛水溶液中，室温反应1-2h，用超纯水清洗干净，N₂吹干，得到醛基功能的玻片基底；

然后在所述醛基功能的玻片基底表面滴加200μL步骤（1）的纳米金，室温反应1 h左右，用超纯水洗去未反应的纳米金，N₂吹干，得到液晶敏感膜；

步骤（5）、液晶生物传感器的制备

将待检测的不同浓度的碱性磷酸酶加入检测液中，迅速混合均匀后滴加到上述液晶敏感膜表面，进行避光反应，酶促金属化反应结束后用超纯水冲洗，N₂吹干，备用；

在上述酶促金属化反应结束后的液晶敏感膜上滴加1~2 µL 5CB液晶分子，盖上步骤（3）的DMOAP修饰的上玻片，即得到用于检测碱性磷酸酶的液晶生物传感器。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，纳米金的浓度为1.41×10^-8 mol/L。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，将玻片浸泡在Piranha溶液中，置于80℃的水浴锅中静置1~2h，反应结束后用大量的超纯水和无水乙醇冲洗，然后用N₂吹干，放置于干烘箱中110℃干燥2~4h，放置于干烘箱中干燥，得到洁净的玻片。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，DMOAP修饰的上玻片的制备方法为：

将洁净的玻片浸入含有0.5-1%的DMOAP水溶液中，室温条件下静置反应20-30min，用无水乙醇清洗未反应的DMOAP，再用大量的超纯水冲洗干净，N₂吹干，放置于烘箱中干燥，得到DMOAP修饰的上玻片基底；

氨基修饰的下玻片的制备方法为：

将洁净的玻片浸入含有1%DMOAP和4-6%APS的醋酸-醋酸钠缓冲液中，在水浴锅中80℃恒温反应1.5h，用乙醇洗净未反应的DMOAP和APS，再用大量超纯水清洗干净，N₂吹干，放置在烘箱中干燥，使玻片表面修饰上长链烷基和氨基官能团。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（5）中，检测液为含有2-8mmol/L抗坏血酸2-磷酸酯和2-8mmol/L硝酸银的0.1-0.2mol/L、pH为9.5-10的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液；液晶敏感膜表面滴加1-2 µL5CB液晶分子。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）制备谷胱甘肽为配体的纳米金具体如下：

向1mL 1%的氯金酸中加入0.10mL谷胱甘肽(GSH，0.24 mol/L)，室温下搅拌2~5分钟，然后向溶液中缓慢滴加1 mol/L NaOH至溶液的pH介于2.5~3.0，溶液中出现大量的浅黄色沉淀，然后利用离心机采用6000~8000 转/分钟的转速离心1分钟，弃去上清液得到Au(Ⅰ)-GSH沉淀，然后将该沉淀用5mmol/L氢氧化钠溶解，加入11 mL超纯水，然后调节溶液pH值至7.0左右，向反应液中缓慢滴加入0.1 mg/mL 硼氢化钠100 μL，直至溶液变成棕黄色，在磁力搅拌器上采用600 转/分钟的转速，室温下反应4 h，采用截留分子量为30kD的超滤管纯化，最后将得到的溶液分散在4 mL超纯水中，4 ℃保存备用。

8.权利要求1-7之一的检测碱性磷酸酶的液晶生物传感器的应用，其特征在于：包括如下步骤：

步骤（1），将不同浓度的碱性磷酸酶加入到检测液中，迅速混合均匀后滴加到权利要求1-6之一的纳米金修饰的液晶敏感膜表面，进行避光反应；所述的检测液为含有抗坏血酸2-磷酸酯和硝酸银的的二乙醇胺-硝酸缓冲溶液；

步骤（2），将步骤（1）的液晶敏感膜用超纯水冲洗，N₂吹干，然后滴加1-2 µL5CB液晶分子，盖上DMOAP修饰的上玻片，得到液晶生物传感器；

步骤（3），然后将上述液晶生物传感器放置在25℃~27℃的恒温加热台上，利用偏光显微镜在正交偏光模式下进行观察、拍照，得到不同浓度碱性磷酸酶的光学响应图像，利用该光学图像上白色光斑的数量以及颜色的变化对碱性磷酸酶进行定性和半定量检测。