[发明专利]含有人巨细胞病毒UL115基因的重组质粒、基因工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种含有人巨细胞病毒UL115基因的重组质粒、基因工程菌及其应用。本发明中通过将人巨细胞病毒的UL115基因插入大肠杆菌克隆表达载体pET32a中获得含有人巨细胞病毒UL115基因的重组质粒，并将该重组质粒转化入原核表达工程菌BL21(DE3)中获得重组质粒表达菌。该菌株可以成功表达带有组氨酸标签的融合蛋白。该融合蛋白可以作为抗原进行相关免疫学实验，为人巨细胞病毒UL115包膜蛋白多克隆抗体和单克隆抗体制备提供原材料，同时也开发HCMV快速诊断试剂盒提供了研发方向，并且为亚单位疫苗的研制，开发新型高效的抗人巨细胞病毒提供了可选材料和新的策略。

技术领域

本发明涉及生物学领域，特别涉及一种含有人巨细胞病毒UL115基因的重组质粒、基因工程菌及其应用。

背景技术

根据流行病学调查发现，HCMV在人群中广泛感染，在发达国家，较下阶层的成人HCMV-IgG阳性率为80％，中上阶层40％～60％；而发展中国家的情况则更为严重，HCMV的感染率达到95％以上。当母亲感染HCMV后，病毒可通过胎盘传播给胎儿，也可以通过产道，母乳进行传播，婴儿身体的各个组织器官尚未完全发育，免疫系统的防御功能较差，因而极易受到HCMV感染的侵害，特别是对刚出生的婴儿的危害性是非常巨大的。HCMV对人类影响如此巨大，在如何预防与检测该两方面是很值得我们去关注的。特别建立针对HCMV感染的早期检测方法用于孕妇的筛查，这对于优生优育及阻断HCMV传播有重要意义，可有效避免病毒激活产生的严重后果。检测是感染后无法避免要进行的工作，预防疾病比控制疾病相对更简单，付出的健康成本也是更低。简单的理解，人群中未受HCMV感染者存在风险，反复受感染者也有风险。似乎控制这种已与人体长期适应的病毒感染，在于使体内病毒量与机体免疫反应平衡在一定水平上。这就提示预防及控制HCMV感染，不仅对先天性感染是必要的，对整体人群的保健都是有意义的。特别免疫功能低下的人群，包括刚出生的免疫系统还没发育健全的婴幼儿，免疫抑制剂患者，还有艾滋病患者。

当下研究一种可以对抗巨细胞病毒的疫苗是最有希望的一种预防HCMV感染的策略。无论从健康和经济效益去考虑，有效病毒疫苗是十分重要的。HCMV结构蛋白由外到内分别是：包膜糖蛋白，被膜蛋白和衣壳蛋白。在病毒识别宿主细胞膜受体，黏附，进入细胞的过程中，包膜糖蛋白起到很重要作用。包膜糖蛋白是病毒的外衣，直接暴露宿主的免疫系统下，免疫系统可以对包膜蛋白异原性识别，亚单位疫苗的研究，包膜蛋白可以说是处于首当其冲的地位。

gB蛋白是HCMV包膜的糖蛋白，Song等学者构建gB蛋白重组质粒的工程菌，并且成功表达了人巨细胞病毒gB蛋白，利用免疫亲和层析的方法提纯gB蛋白，可使血清阴性的志愿者产生中和抗体；MORRIS等研究人员构建AVX601是表达HCMV gB和pp65-IE1的框内融合蛋白的双组分α病毒复制子颗粒疫苗。该疫苗耐受性良好，仅具有轻度至中度的局部反应原性，在一些受试者中报道了轻度至中度的全身性反应原性。Wussow等学者研究表明，构建重组gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合物基因重组质粒的工程菌，用表达gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合物的去免疫猕猴产生的抗体可以部分抵抗猕猴CMV感染；Huadong等研究人员构建老鼠CMV gH/gL/gO三聚体复合物重组质粒的工程菌，使用gH/gL/gO三聚体复合物免疫老鼠后，将MCMV抑制在潜伏期感染，发现可以完全保护老鼠免受MCMV感染。

大肠杆菌表达载体pET32a是一种高表达的原核表达载体，将基因插入到载体的多克隆位点，能够获得融合表达蛋白质。该质粒大小约为5.9kb，用于表达可溶性，具有活性功能的蛋白。该载体使用T7启动子进行高效表达，表达的融合蛋白除了目的蛋白外，还包括109个氨基酸序列的硫氧还原蛋白(用于检测)，His标签以及S·Tag标签(用于纯化)。pET-32a载体具有N端凝血酶酶切位点，N端肠激酶酶切位点。pET32a，pET32b，pET32c载体的差异主要是在于多克隆位点，其他地方完全一致。pET32a表达载体带有氨苄青霉素抗性基因，可以用青霉素作为筛选条件。