[发明专利]一种用于检测眼内液中4种革兰氏阴性细菌的LAMP引物组合及应用

说明书

本发明公开了一种用于检测眼内液中4种革兰氏阴性细菌的LAMP引物组合及应用。本发明首先提供了一种引物组合，由序列1至序列24所示的24种DNA分子组成。所述引物组合可应用于检测待测菌是否为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌或鲍曼不动杆菌，可应用于检测待测样本中是否含有大肠杆菌和/或铜绿假单胞菌和/或肺炎克雷伯氏菌和/或鲍曼不动杆菌。本发明提供的引物组合检测眼内液中4种革兰氏阴性细菌，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的推广价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测眼内液中4种革兰氏阴性细菌的LAMP引物组合及应用。

背景技术

细菌是外源性眼内炎的主要致病菌，大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)是引起外源性眼内炎的主要4种革兰氏阴性细菌。大肠杆菌是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌，直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌。铜绿假单胞菌原称绿脓杆菌，是一种常见的条件致病菌，是眼科感染的主要病原菌之一。肺炎克雷伯菌是肠杆菌科克雷伯氏菌属中最为重要的一类菌(俗称肺炎杆菌)，其所致疾病占克雷伯氏菌属感染的95％以上，是临床分离及医院感染的重要致病菌之一。鲍曼不动杆菌为非发酵革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界，属于条件致病菌，该菌是医院感染的重要病原菌，国内资料表明，鲍曼不动杆菌约占临床分离的不动杆菌的70％以上。

目前临床针对革兰氏阴性细菌的检测方法主要是分离培养、涂片镜检和血清学检测。这些检测方法繁琐，检测时间长，灵敏度低，容易发生漏检和错检，无法满足快速检测的要求。近几年发展起来的分子检测技术，特别是PCR技术，在微生物快速鉴定和检测方面的应用，为细菌的快速检测开辟了新的途径。但是，PCR存在检测时间长、易污染、假阳性率高的缺点，使其应用受到限制。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩增技术，其原理是在一种具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下，识别6-8个区域的4-6条引物，在等温条件下快速、特异地扩增目的基因，可推广应用于快速、准确的检测细菌。LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测眼内液中常见的革兰氏阴性细菌。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种引物组合，可为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)：

(a1)由引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ和引物组Ⅳ组成；

(a2)所述引物组Ⅰ；

(a3)由“所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ和所述引物组Ⅳ中的任意一个、任意两个或三个”和所述引物组Ⅰ组成；

(a4)由所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ和所述引物组Ⅳ中的任意两个或任意三个组成；

(a5)所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ或所述引物组Ⅳ。

所述引物组Ⅰ可由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成；

所述引物Ⅰ-F3可为如下(b1)或(b2)；

(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；