[发明专利]一种检测环境中甲状腺激素干扰物抑制活性的方法

说明书

本发明公开了一种检测环境中甲状腺激素干扰物抑制活性的方法，采用大鼠垂体瘤GH3细胞作为检测手段，半贴壁培养至指数生长期，加入环境样品的有机溶剂提取液与3,3',5‑三碘‑L‑甲腺原氨酸(下简称T3)溶液，继续培养后，加入MTT溶液，通过酶标仪490nm波长检测光密度值，以盐酸胺碘酮为标准化合物，绘制盐酸胺碘酮对T3诱导的GH3细胞生长的抑制剂量‑效应关系标准曲线，进而评价样品中甲状腺激素干扰物的毒性效应。本方法快速简便、成本低廉、高通量，能够得到样品中甲状腺激素干扰物的毒性当量值，可以作为环境样品和可疑甲状腺激素干扰物的快速筛查手段。

技术领域

本发明涉及环境检测技术领域，尤其涉及检测环境中甲状腺激素干扰物抑制活性的方法。

背景技术

甲状腺是脊椎动物非常重要的腺体，属于内分泌器官，其分泌的甲状腺激素是体内至关重要的新陈代谢调节物，在促进机体基础代谢、生长发育等方面发挥重要作用。如果胎儿发育期间甲状腺激素缺乏，将导致体型矮小、智力迟钝、骨骼营养不良以及新陈代谢低下等一些不良症状。同时，与中枢神经系统成熟相关的过程以及骨骼、肝脏和血液等的发育和功能维持都离不开甲状腺激素的调控。

近年来不断有研究证明，环境中的一些内分泌干扰物能影响下丘脑－腺垂体－甲状腺作用轴。这类影响生物体甲状腺激素的合成、分泌、运输、作用和代谢等过程的化合物统称为甲状腺激素干扰物(TDCs，Thyroid Disrupting Chemicals)。

由于甲状腺激素在基础代谢以及生长发育调节方面的重要作用，甲状腺激素干扰引起了科学界巨大的关注，同时环境甲状腺激素干扰物也成为继环境雌激素污染后最重要的一类内分泌干扰物。现有甲状腺激素干扰物的鉴别与毒性评价方法，主要有体外测试方法(in-vitro)与活体测试方法(in vivo)两种，离体方法主要有T-screen筛选方法、重组雌激素受体基因酵母测试方法等；活体测试根据研究者研究领域等方面的不同，有利用非洲爪蟾、大鼠、兔、鸡及鱼的。但现有这些检测方法存在操作复杂，而且时间长，费用高，难以满足现有的快速筛查的需求。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种检测环境中甲状腺激素干扰物抑制活性的方法，该方法快速简便、成本低廉、高通量，能够反映环境样品中甲状腺激素干扰物效应，并通过标准曲线计算得到样品中甲状腺激素干扰物的毒性当量值，可以作为环境样品和可疑甲状腺激素干扰物的快速筛查手段。

为实现上述目的，本发明的技术方案是：

采用大鼠垂体瘤GH3细胞作为检测手段，半贴壁培养至指数生长期，加入环境样品的有机溶剂提取液，继续培养后，加入MTT溶液，通过酶标仪490nm波长检测光密度值，以盐酸胺碘酮为标准化合物，绘制盐酸胺碘酮对T3诱导的GH3细胞生长抑制的剂量-效应关系标准曲线，进而评价样品中甲状腺激素干扰物的毒性效应。

本发明检测环境中甲状腺激素干扰物抑制活性的具体方法如下：

一种检测环境中甲状腺激素干扰物抑制活性的方法，其包括以下步骤：

S1、接种：取96孔板，选择生长良好的大鼠垂体瘤GH3细胞(处于对数生长期，显微镜下观察，培养液中无杂质、细胞无悬浮或微量悬浮、细胞饱满透明，细胞贴壁均匀、细胞发亮)制备5×10⁴个/mL的细胞悬液，按照200μL/孔接种，于含5％CO₂的培养箱中37℃条件下培养2-3d；

S2、上样：取步骤S1得到的96孔板，弃去培养液；取离心管，每个离心管中加入990μL无酚红F12培养基，再加入5μL溶于DMSO的待测样品及5μL溶于DMSO的T3溶液；另外取离心管，添加5μLDMSO及5μL溶于DMSO的T3溶液作为对照，按每孔200μL添加于96孔板中，在CO₂培养箱中暴露96h；