[发明专利]转氨酶突变体及其应用

说明书

本发明提供了一种转氨酶突变体及其应用。该转氨酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，突变的氨基酸位点包括T7C+S47C位点。具有上述突变位点的转氨酶突变体，其酶活性和/或稳定性大大提高，能够在相对极端的环境中应用。而且，具有上述突变位点的转氨酶突变体可以进一步通过固定化技术制备成固定化酶，且其固定化酶的活力和稳定性较高，能够被多次回收再利用，适合应用于填充床连续流反应。

技术领域

本发明涉及酶工程领域，具体而言，涉及一种转氨酶突变体及其应用。

背景技术

ω-转氨酶(ω-TA)属于转移酶类，同其他的转氨酶类一样，催化一个氨基与酮基互换的过程。大部分情况下ω-转氨酶是指一类酶，只要某个酶催化的转氨反应中，反应的底物或产物中不含有α-氨基酸，就可以称该酶为ω-转氨酶。ω-转氨酶以酮类化合物为原料，通过立体选择性地转氨基作用，可以高效生产手性胺。对映体手性胺是具有广泛生物活性的许多药物化合物的关键中间体(ChemBioChem.9，2008，363-365，Chem.Commun.46，2010，5569-5571，Biotechnol.Bioeng.108，2011，1479-1493)。因其底物相对廉价、产物纯度高的特点，受到研究人员越来越多的关注(Green Chemistry,2017,19，2:333-360.)。并且转氨酶已经显现出应用于生产手性胺的希望(Organic Process Research&Development,2010,14,234-237)。

尽管使用转氨酶生产手性胺的进展已被高度关注，但酶促方法在放大生产应用中存在很多问题。如酶活性低及酶用量大导致发酵成本增加；易受反应体系中有机溶剂的影响而变性失活等。

另外，在分离产品胺的过程中，只能通过使酶变性失活形成沉淀后除去并丢弃，无法再利用；或将产品用有机溶剂从水溶液中萃取出，酶继续存在于水溶液中，但此时由于pH及溶剂等众多苛刻条件的影响使酶失活，无法再利用。

现有技术中有报道通过固定化技术将酶进行固定化以提高酶的回收再利用的问题。然而，目前固定化技术在脂肪酶、青霉素酰化酶、淀粉酶等领域的研究较多，因为这些酶相比其他酶有更好的稳定性，固定化后酶活性的损失较低。而对于大部分转氨酶而言，其稳定性较差，尤其是当体系中存在有机相时，固定化操作过程中容易引起酶活损失，因而，对转氨酶的固定化的研究较少，适合连续化反应的固定化的转氨酶的研究更少。

对于能够催化下列底物1和底物2进行氨基转换反应的转氨酶而言，如果用游离的转氨酶催化该反应，游离酶不能回收，只能使用一次。且由于反应体系中酶蛋白的存在使得后处理乳化现象极其严重，产物分离困难。

若将所用转氨酶固定化后，理论上可以实现酶的回收利用，但现有的用于催化底物1或底物2的转氨酶固定化后的酶活回收率依旧很低。而且，由于现有的底物酮(氨基受体)大多都水溶性不好，无法在纯水相中进行连续化反应。若要实现连续化反应，则需要加入足够的有机助溶剂使底物溶解，但现有的转氨酶对温度、pH及有机溶剂的耐受性差，有机溶剂易使其失活。因而也难以实现其固定化处理。

因此，需要对现有的能够催化上述底物的转氨酶进行改进，以改善其在有机溶剂等极端环境中稳定性差而应用受限的问题。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种转氨酶突变体及其应用，以解决现有技术中的转氨酶活性在极端环境中耐受性差而使得应用受限的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种转氨酶突变体，该转氨酶突变体具有SEQ ID NO:1所示序列发生氨基酸突变的序列，发生氨基酸突变的位点包括T7C+S47C位点。