[发明专利]一种基于MALDI-TOF-MS检测肺癌34个突变位点的试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于MALDI‑TOF‑MS检测肺癌34个突变位点的试剂盒，该试剂盒包含多重PCR扩增反应引物，如SEQ ID NO：1～16所示；以及单碱基延伸引物，如SEQ ID NO：17～48所示。本发明可以同时检测EGFR基因的23个位点、KRAS基因的7个位点、BRAF的1个位点和PIK3CA基因的3个位点。通过本发明，可以将4个基因的34个位点在2个孔中进行目的片段扩增和8个孔内进行单碱基延伸，本发明可以对异常样本中可能存在的这4个基因中的34个位点突变同时进行检测和分析。通过本发明的试剂盒，了解患者对药物敏感性的相关因素，对于肺癌患者进行个体化治疗，以及靶向药物适用有着重要的指导意义。

技术领域

本发明涉及肺癌突变位点检测技术领域，更具体地，涉及一种基于 MALDI-TOF-MS检测肺癌34个突变位点的试剂盒。

背景技术

肺癌是当今世界最常见的恶性肿瘤之一，其肿瘤发病率和致死率在男性均居 首位，在女性中仅次于乳腺癌。目前化疗是治疗中、晚期肺癌的主要手段，也是 患者术前、术后辅助治疗的方法之一。临床上部分患者化疗效果欠佳、化疗失败， 其主要原因是肿瘤细胞对抗癌药物不敏感或产生耐药。因此，了解患者对药物敏 感性的相关因素，对于肺癌患者进行个体化治疗，以及靶向药物适用指导显得尤 为重要。

临床发现EGFR基因突变与NSCLC靶向治疗的疗效具有相关性，绝大多数 携带EGFR基因突变的病人疗效显著。大量研究资料表明EGFR基因突变主要集 中在酪氨酸激酶区(tyrosine kinase coding domain)外显子18-21上，其中19外显 子多为框内缺失(746-753)性突变，约占所有突变的45％；21外显子多为替代突变 (主要是L858R)，约占所有突变的40％。目前普遍认为，这两个热点突变可以增 强肿瘤细胞对TKIs的敏感性，并且可作为TKIs治疗的有效预测指标。因此，检 测EGFR基因突变对于指导NSCLC病人临床用药具有重要的参考价值。

RAS基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——HRAS、KRAS和NRAS， 分别定位在11、12和1号染色体上。在RAS基因中，KRAS对人类癌症影响最大。 正常时，它能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并 阻止细胞自我毁灭，不能产生正常RAS蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增 殖失控而癌变。KRAS突变发生于多种癌症，例如肺癌、结肠癌等。90％的突变 发生在12、13位密码子，可导致p21-ras蛋白的生长信号的异常变化。该基因是 TKIs治疗的靶分子，携带有KRAS基因突变的患者对TKIs治疗不敏感。过度的 生长信号可刺激细胞生长和增殖从而导致了癌症的发生。

大量临床研究表明，靶向药物对未发生KRAS基因突变的患者有效率可达 到60％，而对已发生KRAS基因突变的患者则完全无效。KRAS基因检测是目前 医生了解患者癌基因状况最直接、最有效的方法。通过检测KRAS基因有没有 突变，可以筛选出抗EGFR(表皮生长因子受体)靶向药物治疗有效的大肠癌患 者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而延长患者生存期。对于没有突变的患者， 则能减少不必要的治疗费用和毒副作用。

BRAF是一种癌基因，它编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，RAS/RAF/MEK/ ERK/MAPK通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生 长、分化和凋亡等。研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如肺癌、恶性黑色素瘤、 结直肠癌等均存在不同比例的BRAF基因突变。大约80-90％的BRAF基因突变 发生在exon15的1799核苷酸上，T突变为A，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代 (V600E)。目前认为，V600E突变可模拟T599和S602两个位点的磷酸化过程， 从而使BRAF蛋白异常激活。BRAF突变状态与多种肿瘤的发生、发展及临床结果有关。

临床研究显示，BRAF基因突变患者对EGFR靶向药物可能存在原发耐药， 因此NCCN建议，在使用靶向药物是，应对KRAS基因野生型患者进一步检测 BRAF基因状态。BRAF基因突变检测能提高临床治疗的针对性，指导靶向药物 的合理使用，避免无效或治疗不当造成的病人病情延误，降低治疗风险。