[发明专利]水解酶的高通量筛选方法

说明书

本发明属于蛋白质工程领域，提供一种水解酶的高通量筛选方法，所述方法包括：利用平板显色法对水解酶突变体文库进行初筛，根据菌落的颜色变化筛选得到可能具有水解酶活性的突变体；将初筛得到的突变体经微孔板光谱法进行复筛，得到具有水解酶活性的突变体；将复筛得到的突变体进行摇瓶培养，确定水解酶突变体的活性。本发明的方法普适性强、灵敏度高、简单有效、通量高。

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，具体涉及一种酶的高通量筛选方法。

背景技术

随着酶工程和代谢工程的发展，建立一个合适、有效的高通量筛选方法是酶蛋白理性和非理性改造以及天然酶筛选成功的关键之一。一个有效的高通量筛选方法是对筛选过程的强化，其原则是灵敏、可重复、稳定、可行。

目前应用较多的高通量筛选方法如下所述。第一种是pH指示剂加入法，它是最直接、最方便的一种高通量筛选方法，主要针对那些有氢离子释放的水解反应。第二种是指示剂间接添加法，它是利用辅助试剂和辅助酶将目标酶反应的底物或产物再进行另一个反应，从而产生紫外或可见光光谱范围内的光吸收变化，间接指示目标酶的酶活性高低。第三种方法是酶串联法，它是指通过在一个微生物细胞内同时共表达两个酶，利用其中一个酶的酶活来指示目标酶的酶活。第四种方法是平板筛选法，通过将含有目标酶的微生物培养在含有底物的琼脂平扳上，根据平板上颜色的变化、荧光强弱或水解圈的大小来筛选出人们需要的目标酶，这种方法简单、易于操作，常用于对酶蛋白进行初步筛选。

水解酶(Hydrolase)是普遍存在于自然界的酶，在医药、食品、洗涤剂化学合成及油脂等工业领域具有广泛的应用。建立一个合适的、有效的高通量筛选方法是水解酶改造以及天然水解酶筛选成功的关键之一。近年来，研究人员开发了平板筛选法对水解酶进行筛选，其基本原理是平板上微生物细胞中的水解酶水解底物乙酸萘酯生成产物萘酚，萘酚再与重氮染料发生偶联反应，导致菌落显现颜色，以颜色的深浅作为筛选的依据(Roodveldt,C.,Tawfik,D.S.(2005).Directed evolution of phosphotriesterase fromPseudomonas diminuta for heterologous expression in Escherichia coli resultsin stabilization of the metal-free state.Protein Eng.Des.Sel.18,51-58.)。然而该方法的灵敏度较低、假阳性率偏高。

发明内容

针对目前水解酶筛选方法假阳性率高这个问题，本发明提供一种高通量筛选方法，以解决现有技术问题。

具体地，本发明的水解酶的高通量筛选方法包括步骤：

1)初筛：利用平板显色法对水解酶突变体文库进行初筛，根据菌落的颜色变化筛选得到可能具有水解酶活性的突变体；

2)复筛：将初筛得到的突变体经微孔板光谱法进行复筛，得到具有水解酶活性的突变体；

3)活性确定：将复筛得到的突变体进行摇瓶培养，确定突变体的水解酶活性；优选地，突变体的水解酶活性是针对目标底物的活性。

其中，本发明的水解酶指能够催化水解酯键断裂的酶；优选地，所述水解酶为2-甲基丁酸侧链水解酶；进一步优选地，所述2-甲基丁酸侧链水解酶的野生型氨基酸序列如SEQID NO:1所示。

本发明所述的水解酶突变体文库可以利用理性改造或非理性改造的手段对水解酶的编码基因进行突变而得到。所述突变体文库是以微生物，如细菌为表达载体。本领域公知，由于突变体活性不一，表达突变体的菌落所表现的颜色也会不同。突变体文库的制备、根据菌落颜色判断酶活性等都属于本领域常识。

本发明所使用的平板显色法、微孔板光谱法以及摇瓶培养突变体这些方法都是本领域的常规方法，本领域技术人员根据说明书的描述可以实现所述方法并实现相应的目的。