[发明专利]一种用于检测眼内液中5种革兰氏阳性细菌的LAMP引物组合及应用

说明书

本发明公开了一种用于检测眼内液中5种革兰氏阳性细菌的LAMP引物组合及应用。本发明首先提供了一种引物组合，由序列1至序列30所示的30种DNA分子组成。所述引物组合可应用于检测待测菌是否为表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌或酿脓链球菌，可应用于检测待测样本中是否含有表皮葡萄球菌和/或金黄色葡萄球菌和/或粪肠球菌和/或屎肠球菌和/或酿脓链球菌。本发明提供的引物组合检测眼内液中5种革兰氏阳性细菌，具有高特异性和高灵敏度，可以实现简便、快速、准确检测。本发明具有重大的推广价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测眼内液中5种革兰氏阳性细菌的LAMP引物组合及应用。

背景技术

革兰氏阳性细菌是引起细菌性眼内炎的主要致病菌。高敏等回顾性分析2010年1月至2015年4月北京同仁医院细菌培养阳性的角膜炎患者146例，其中56.2％(82例)的病原菌为革兰氏阳性细菌。表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(EnterococcusFaecium)和酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)是临床最为常见的5种革兰氏阳性致病细菌。表皮葡萄球菌是滋生于生物体表皮的一种细菌，属于正常菌群类型，多数为非致病菌，少数可导致疾病，大多数细菌性眼内炎是由表皮葡萄球菌引起。金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。粪肠球菌和屎肠球菌是白内障术后和眼部外伤后常见细菌性病原菌。酿脓链球菌，即A群链球菌(Group A streptococcus，GAS),为β溶血，是引起眼内炎症的重要致病菌之一。

目前临床针对革兰氏阳性细菌的检测方法主要是分离培养、涂片镜检和血清学检测。这些检测方法繁琐，检测时间长，灵敏度低，容易发生漏检和错检，无法满足快速检测的要求。近几年发展起来的分子检测技术，特别是PCR技术，在微生物快速鉴定和检测方面的应用，为细菌的快速检测开辟了新的途径。但是，PCR存在检测时间长、易污染、假阳性率高的缺点，使其应用受到限制。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近年来发展出的一种敏感、特异、简便、快捷的核酸扩增技术，其原理是在一种具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下，识别6-8个区域的4-6条引物，在等温条件下快速、特异地扩增目的基因，可推广应用于快速、准确的检测细菌。LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测眼内液中常见的革兰氏阳性细菌。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种引物组合，可为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)或(a5)：

(a1)由引物组Ⅰ、引物组Ⅱ、引物组Ⅲ、引物组Ⅳ和引物组Ⅴ组成；

(a2)所述引物组Ⅰ；

(a3)由“所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ、所述引物组Ⅳ和所述引物组Ⅴ中的任意一个、任意两个、任意三个或四个”和所述引物组Ⅰ组成；

(a4)由所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ、所述引物组Ⅳ和所述引物组Ⅴ中的任意两个、任意三个或任意四个组成；

(a5)所述引物组Ⅰ、所述引物组Ⅱ、所述引物组Ⅲ、所述引物组Ⅳ或所述引物组Ⅴ。

所述引物组Ⅰ可由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成；

所述引物Ⅰ-F3可为如下(b1)或(b2)；

(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；