[发明专利]一种特异识别大肠杆菌O157双链DNA的TALENs制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种特异识别大肠杆菌O157双链DNA的TALENs制备方法与应用，属于生物技术领域。本发明是根据大肠杆菌O15716S rDNA为靶基因构建、测序和筛选，获得完整TALENs基因，通过载体质粒，利用大肠杆菌原核表达系统，实现TALENs蛋白的高效可溶性表达，经纯化获得特异识别大肠杆菌O157双链DNA的TALENs蛋白。并且，本发明将所制备的TALENs用于大肠杆菌16S rDNA的检测。本发明将可用于大肠杆菌种属检测。

技术领域

本发明涉及一种体外特异识别大肠杆菌O157双链DNA的TALENs制备方法，属于生物技术领域，用于制备特异识别大肠杆菌O157双链DNA的TALENs与研制可以检测大肠杆菌O157的免疫试剂盒及诊断相关疾病的用途中。

背景技术

转录激活样效应因子(transcription activator-like effectors TALEs)是植物致病菌黄单胞杆菌通过III型分泌系统注入到宿主细胞内的一类蛋白效应子。其识别DNA的机制在于DNA靶点上的一个核苷酸被重复序列可变的双氨基酸残基识别具有高度专一性，能够对DNA进行高精确地定向结合，这种特异的专一性识别为特定靶基因的结合和检测提供可能，因此TALEs有可能成为食源性致病菌靶基因特异检测的新工具。

TALEs是由多种黄单胞杆菌所分泌的天然细菌效应物蛋白，主要通过调控宿主植物的基因转录，从而促进黄单胞杆菌在植物体内的繁殖和扩散。天然TALEs主要由位于N端的转运信号、位于C端的核定位信号和转录激活结构域以及位于中间的DNA结合结构域三部分组成。DNA结合结构域由包含33-35(通常为34)个氨基酸残基的重复单元串联而成，介导DNA特异识别与结合。TALEs识别DNA的机制在于DNA靶点上的一个核苷酸被重复序列上的RVD识别，具有高度专一性，能够在一个较大的识别位点对靶DNA进行高精确的定向结合，从而为分子生物学提供了一种精确的基因编辑工具，在用于基因组订制化方面便显出较高的效率和潜力。同时，这种特异的专一性识别还可能应用于特定靶基因的结合与检测。

天然TALEs所包含的重复单元数为1.5-33.5。每个重复单元序列高度保守，主要区别在于第12和第13位的重复可变双残基。研究发现每个重复单元的RVD决定了其所识别的核苷酸，且其识别遵循一个简单法则：NI＝A，HD＝C，NG＝T，NN＝G or A。对TALE蛋白晶体结构的分析发现，每个TALE重复单元由一个短α螺旋和一个长α螺旋通过一个包RVD的环相连形成，第12位的氨基酸残基主要起稳定RVD环的作用，而第13位的氨基酸残基决定TALE蛋白所识别的核苷酸，所有的重复单元相互连接在一起形成可以镶嵌在TALE蛋白所识别的DNA的大沟中的右手超螺旋结构。结构比较进一步展示了TALE蛋白类似于弹簧的伸展性。TALE蛋白识别核苷酸的简单法则和其晶体结构解释了TALEs识别DNA的特异性，且由于每个重复单元与其所识别核苷酸一一对应，因此，理论上可以人为设计能够识别并结合任何DNA序列的TALEs蛋白。这一特性已经被用来构造切割特异双链DNA序列的DNA酶TALEN，成功用于在细胞基因组中引入定点突变、定点敲除等操作。总之，TALE蛋白识别核苷酸简单法则的破译以及其晶体的解析已经为TALEs在基因组定点操控中的应用奠定了理论基础。这些结构信息提供了TALEs蛋白改造的基础。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种特异识别大肠杆菌O157双链DNA的TALENs。

本发明的第二个目的提供一种特异识别大肠杆菌O157双链DNA的TALENs制备方法。

本发明的第三个目的提供特异识别大肠杆菌O157双链DNA的TALENs制备检测试剂盒中的用途。

本发明的技术方案概述如下：