[发明专利]一种体外扩增和规模化培养间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种体外扩增和规模化培养间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：

步骤一：脐带处理：将脐带用D-Hank’s液冲洗3～5次后用剪刀剪碎成约0.7～1.0mm3的小块；

步骤二：消化：将步骤一中所制得的脐带块加入0.1％胶原酶Ⅱ消化30～35分钟，然后再加入0.25％胰酶进行消化30～35分钟；

步骤三：离心：将步骤二中的溶液倒入离心机中，离心机离心20～25分钟，然后取中间白膜层，并且加入PBS洗涤2次；

步骤四：培养：将步骤三洗涤后的细胞接种于20％～40％胎牛血清培养液Ⅰ中，然后置于37℃、5％二氧化碳和饱和湿度的培养箱中进行培养，静置2～3天；

步骤五：培养液更换：将步骤四中静置2～3天后的培养液Ⅰ内的培养液进行更换，并且去除非贴壁细胞，同时每隔2～3天进行换液一次；

步骤六：消化：在步骤五进行之后，将培养液放置于显微镜下观察，当观测到待贴壁细胞80％～90％后，加入0.25％胰酶消化；

步骤七：传代培养：用吸管从步骤六消化后的溶液中吸取适量的细胞，并且以2*104/ml密度接种于20％～40％胎牛血清培养液Ⅱ中进行传代培养，置于37℃、5％二氧化碳和饱和湿度的培养箱中进行培养，静置2～3天，然后进行步骤五和步骤六，以此类推。

2.根据权利要求1所述的一种体外扩增和规模化培养间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤一中脐带为刚刚出生的新生儿所产生的脐带，剪刀经过300℃～500℃高温灭菌去除剪刀表面的细菌。

3.根据权利要求1所述的一种体外扩增和规模化培养间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤二中是在无菌条件下进行。

4.根据权利要求1所述的一种体外扩增和规模化培养间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤三中离心机以2000r/min进行离心运动。

5.根据权利要求1所述的一种体外扩增和规模化培养间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤四和步骤七中胎牛血清培养液中还含有100kU/L青霉素和100mg/L链霉素。

6.根据权利要求1所述的一种体外扩增和规模化培养间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤五中的处理的非贴壁细胞通过收集箱进行集中收集。