[发明专利]硒代酪氨酸翻译系统及其应用

说明书

本发明涉及一种氨酰基‑tRNA合成酶突变体，其为一种正交氨酰基‑tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或其具有相同酶活性的保守性变体或同源物。本发明还提供一种硒代酪氨酸翻译系统，其包含：(i)硒代酪氨酸；(ii)所述正交氨酰基‑tRNA合成酶；(iii)正交tRNA，其中所述正交氨酰基‑tRNA合成酶用硒代酪氨酸优先氨酰化所述正交tRNA；和(iv)编码目标蛋白质的核酸，其中所述核酸含有所述正交tRNA特异性识别的至少一个选择密码子。本发明还提供利用上述硒代酪氨酸翻译系统设计改造蛋白酶的方法，以及该方法编码产生的蛋白酶。

技术领域

本发明属于生物化学领域。具体地，本发明提供一种氨酰基-tRNA合成酶突变体，其为一种正交氨酰基-tRNA合成酶，其含有的氨基酸序列选自由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的保守性变体组成的组，其中所述保守性变体具有与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列相同的酶活性。本发明还涉及一种硒代酪氨酸(简写为SeHF)翻译系统及其应用。

具体而言，本发明涉及利用正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶的配对将硒代酪氨酸定点特异性插入目标蛋白质的硒代酪氨酸翻译系统，和利用所述翻译系统在目标蛋白质中定点特异性插入硒代酪氨酸的方法。本发明还涉及一种用这套翻译系统和这种方法设计改造目标蛋白酶的方法，以及该方法产生的含有硒代酪氨酸的突变蛋白酶，例如，插入硒代酪氨酸的放射形土壤杆菌磷酸三酯酶(简写为arPTE)突变体，以及插入硒代酪氨酸的放射形土壤杆菌磷酸三酯酶突变体的应用。

背景技术

酪氨酸在许多酶催化剂中普遍存在，它的作用包括：1、底物直接亲核攻击(如DNA拓扑异构酶等)；2、去质子化过程中的广义碱(如糖苷水解酶等)；3、离去基团的广义酸质子化(如酪氨酸苯酚裂解酶等)；4、活性部位的氢键供体/受体或电排斥(如酮类固醇异构酶等)；5、阳离子-π相互作用(如萜类环化酶等)；6、参与氧化还原和电子转移反应(如核糖核苷酸还原酶、FtmOx1等)；7、直接金属配位(如过氧化氢酶、半乳糖氧化酶等)。为了探讨酪氨酸残基在酶催化作用中的机理并更好地设计改造酶，我们将酶活性位点上的酪氨酸突变为带有金属或者邻位取代的非天然氨基酸(简写为UAA)。但是，由于空间位阻，在酶活性位点引入外来原子可能会显著损害其酶活性，因此，我们需要采取一种最小化降低酶活性损伤的策略，即对酶活性位点的氨基酸采取单原子置换。

硒与氧的主族相同，硒的范德华半径为1.9埃，而氧的半径为1.52埃。我们选择合成并遗传插入2-氨基-3-(4-氢硒苯基)丙酸(简称硒代酪氨酸或SeHF)，它与酪氨酸相比有一个侧链上单个氧-硒原子取代，因此可以提供一种有价值的机制工具来研究酪氨酸在酶催化剂中的作用。同时，与苯酚(pK_a＝10)相比，苯基烯醇侧链的pK_a(pK_a＝5.9)显著降低，苯基硒酸盐阴离子的亲核性增强，这也为更好地设计催化酶提供了良好机会。此外，硒可用于通过多波长反常散射定相法来测定蛋白质结构。受含有硒代半胱氨酸的天然或设计酶启发，硒代酪氨酸也可用于设计具有过氧化物酶和脱卤素酶活性的人造酶。

磷酸三酯酶(简写为PTE)是具有多种底物的双金属蛋白，底物之一的对氧磷是一种最常用的杀虫剂。使用金属活化的水作为亲核试剂，PTE可以通过简单的一步S_N2置换反应裂解甲基对氧磷(简写为DNP)的P-O键，生成磷酸二甲酯(DMP)和对硝基苯酚(PNP)，而不涉及任何共价的酶-底物中间体，使其成为理想的酶设计模型。此外，更好地了解和改进PTE催化活性对保护环境也具有一定的重要性。