[发明专利]一种降低苹果外植体褐变率的培养方法

说明书

本发明涉及一种降低苹果外植体褐变率的培养方法。特征在于通过总酚含量连续测定法确定苹果外植体的采集培养时机，以此降低苹果外植体的褐变率；于苹果开始发芽时，每隔7天，采集1～2cm的茎段，用液氮研磨后，称取样品，采用福林酚法测定枝条中总酚含量；直至连续两次测定的总酚含量值之间变化幅度为0～10％。本发明技术方法，操作技术简单，外植体进瓶褐变率低，褐变率仅为10％以下；污染率低，污染率8％以下；成活率高，苹果外植体成活率可达到90％以上。本发明技术方法应用范围广，适用于绝大多数苹果品种。

技术领域

本发明属于苹果脱毒种苗工厂化繁育技术领域，特别涉及一种降低苹果外植体褐变率的培养方法。

背景技术

苹果作为我国农业部规划的11大优势农产品之一，目前我国栽培总面积3150万亩、总产量2050万吨，总面积以及总产量分别占世界39.8％、34.7％，栽培面积和产量高居世界第一，是世界上最大的苹果生产国。苹果生产在促进我国农业增效、农民增收和农业经济发展中具有举足轻重的地位。

组织培养技术是园艺作物快速繁殖的主要技术，具有无性繁殖，能保持品种的优良性状、繁殖速度快、育苗周期短、环境条件不受季节限制、生产的种苗整齐度高等优点。目前我国已将组织培养技术广泛应用于果树育苗生产中。尽管国内在果树脱毒苗木组培快繁方面做了较多的研究工作，但只有少部分进入到工厂化生产阶段。其中苹果外植体进瓶困难，褐变率高是其实现规模化生产存在的一个制约因素。

在植物组织培养过程中，外植体的褐变是导致培养失败的主要原因。褐变又称酚污染，在植物组织培养过程中经常出现，褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物数量多少及多酚氧化酶活性有直接关系。很多植物，尤其是木本植物都含有较高的酚类化合物，因此褐变现象在木本植物的组织培养中更为常见。苹果、梨等蔷薇科植物多酚类物质含量高，多酚氧化酶的活性强，外植体褐变严重，尤其在生长季节更是如此。诱发褐变的原因比较复杂，外植体的生理状态、基因型、同一基因型的不同栽培条件、营养状况、生长部位和大小都会影响褐变的发生。陈蕾等(2008)研究结果发现，不同年限取材的外植体褐变率差异很大，木质化程度越高，褐变越严重。Bonga(1982)认为外植体越小，切面与体积的比率越大，伤害及褐变的程度就越大。外植体过大不宜于消毒处理，过小又褐变现象严重。目前还没有一种既定有效的方法来避免褐变现象的产生，关于用抗氧化剂解决褐变的报道有很多，何琼英等(1995)在抗坏血酸(Vc)对香蕉吸芽外植体预处理阻止褐变的研究中发现，Vc处理外植体能减轻外植体褐变，提高芽丛诱导率，其原理是Vc在PPO的作用下，能将醌还原成酚，可以减少褐变的发生。而陈蕾等(2008)试验得到的结论为在培养基中添加75mg/L的Vc可减少褐变的发生，但褐变率仍然高达60％。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚类物质的专一性吸附剂，在生化置备中常用做酚类物质和细胞器的保护剂，可用于防止褐变(姚洪军，1999)。但也有报道吸附剂有时有副作用，如活性碳(AC)和PVP可以使腰果的组织培养物坏死(李俊芳和侯义龙，2006)。陈蕾等(2008)研究结果表明，进瓶前水培处理，可以降低外植体氧化酶活性，降低褐变发生率。

虽然以上研究对组培过程中防止外植体褐变技术进行了一定的研究，但是在实践中我们发现利用以上技术在应用过程中存在一定的局限性。如水培时间过长，外植体容易发生萎蔫，时间过短，褐变率高，容易污染。VC、PVP和活性炭虽然能降低褐变的发生，但是效果有限。

发明内容

为了解决以上现有技术中苹果外植体进瓶褐变严重，污染率高，成活率低的问题，本发明提供了一种技术简单、成本低、褐变率低，污染率低，成活率高，适合绝大多数苹果品种的降低苹果外植体褐变率的培养方法。

本发明提供的技术方案如下：

一种降低苹果外植体褐变率的培养方法，特殊之处在于：通过总酚含量连续测定法确定苹果外植体的采集培养时机，以此降低苹果外植体的褐变率；

所述总酚含量连续测定法的具体测定过程为：