[发明专利]一种热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体及其编码基因

说明书

本发明涉及蛋白质分子改造领域，具体涉及一种热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体及其编码基因和应用。本发明所述的碱性蛋白酶BmP突变体的突变位点为：T175I、G210Q和G270S。本发明突变体BmP‑mut在75℃水浴5min后的酶活保留率为70％，而碱性蛋白酶BmP在75℃水浴5min后的酶活保留率仅为9％。因此，本发明的获得的碱性蛋白酶突变体BmP‑mut具有良好的热稳定性，为其产业化应用奠定基础。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体及其编码基因和应用。

背景技术

蛋白酶能使蛋白质降解生成氨基酸、多肽，因其也能够分解多肽，所以也称为肽酶。由于蛋白酶具有的水解作用，蛋白酶被广泛用于食品、洗涤、饲料等工业领域。蛋白酶根据作用pH环境，可以分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及碱性蛋白酶。酸性蛋白酶主要来源于曲霉、木霉等丝状真菌，中性和碱性蛋白酶主要来源于芽孢杆菌。

目前芽孢杆菌属蛋白酶的研究主要集中于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌蛋白酶，其他芽孢杆菌类的蛋白酶研究相对较少。本实验室前期通过克隆表达得到了莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)的碱性蛋白酶简称BmP，通过对不同蛋白质原料(包括豆粕、羽毛等)的分解实验，发现BmP具有很好的分解能力，在食品及饲料等工业领域具有很大的应用潜力。但是BmP热稳定性差，在高温(温度大于70℃)下容易分解失活，限制了其产业化应用。因此提高BmP的热稳定性，是BmP产业化应用急需解决的问题。

中国专利申请201110220386.3从微生物特别是嗜碱芽孢杆菌分离野生型碱性蛋白酶基因，对其Glu110、Glu134的氨基酸残基进行突变，经在枯草芽孢杆菌中高效表达，检测其发酵液酶活力达到1985U/mL，在40℃下，该低温碱性蛋白酶(Glu110&134Ala)比野生型碱性蛋白酶活力提高了28％；在10℃下，比野生型碱性蛋白酶活力提高了62％。

中国专利申请201080019156.4提供一种碱性蛋白酶变体，其源自于由SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列构成的或由与其具有90％或更高一致性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶，该变体具有突变，其中一个或多个选自于所述SEQ ID NO：2表示的氨基酸序列的(a)位点6、(b)位点15、(c)位点16、(d)位点65、(e)位点66、(f)位点82、(g)位点83、(h)位点204、(i)位点319和(j)位点337或其对应位点的氨基酸残基被取代。

201310243800.1涉及一种耐有机溶剂蛋白酶，具体涉及其突变基因及其编码的蛋白质。从序列表的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3可见，本发明所述耐有机溶剂碱性蛋白酶在原核苷酸序列的第385或第436发生了定点突变，即其成熟肽段的第24位突变氨基酸为谷氨酸或者谷氨酰胺；第41位氨基酸为丙氨酸或者赖氨酸。突变后的四种编码后的蛋白质的有机溶剂，特别是亲水性有机溶剂的耐受性明显大大加强。

发明内容

本发明对来源于莫海威芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)碱性蛋白酶BmP进行蛋白质分子改造，从而提高BmP在高温环境下的稳定性，为BmP的产业化应用奠定基础。

本发明的目的是提供一种热稳定性高的BmP的突变体BmP-mut。

本发明的再一目的是提供提高热稳定性BmP突变体BmP-mut的编码基因。

一种热稳定性高的碱性蛋白酶BmP突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。