[发明专利]一种利拉鲁肽中间体多肽的制备方法

权利要求书

1.一种融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白为Leading Peptide-DDDDK-GLP-1(7-37)，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，在利拉鲁肽制备中，采用如下前导肽：

MATKAVSVLKGDGX₁VQGIINFEQKESNGX₂VKVWGSIKGLX₃EGLHGFHVH KFVNQHLCGX₄HLVALX₅LV，

X ₁和X₂均为P；X ₃，X ₄和X₅分别为T、S和Y。

2.一种重组表达载体，其特征在于：含有编码权利要求1所述融合蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于：通过将所述的编码基因克隆进入质粒载体pET-28a(+)中获得重组表达载体pET-28a(+)-Leading Peptide-DDDDK-GLP-1(7-37)。

4.一种包含权利要求3所述的重组表达载体的重组工程菌，其特征在于：采用所述的重组表达载体pET-28a(+)-Leading Peptide-DDDDK-GLP-1(7-37)转入到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到。

5.一种权利要求4所述的重组工程菌在重组利拉鲁肽中间体GLP-1(7-37)表达方面的应用。

6.一种利拉鲁肽中间体GLP-1(7-37)的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)合成编码基因，所述编码基因编码权利要求1所述的融合蛋白；

2)将编码基因连接到表达载体中；

3)将带有编码基因的重组表达载体转化到大肠杆菌中，构建重组工程菌；

4)重组工程菌发酵，诱导胞内不溶性包涵体形式的融合蛋白的表达，所述融合蛋白氨基酸序列为SEQ ID N0.1所示；

5)将菌体破碎，收集包涵体，然后将包涵体经过洗涤和变复性；

6)酶切转化和分离纯化得到中间体多肽GLP-1(7-37)。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤2)中编码基因与表达载体的连接方式为通过Hind III/Nco I酶切位点插入到质粒载体pET-28a(+)相应酶切位点中。

8.根据权利要求6或者7所述的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中重组工程菌的发酵采用高密度发酵，诱导表达所用的诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷。

9.根据权利要求6或者7所述的制备方法，其特征在于：所述步骤5)中将洗涤后的包涵体在pH为10-12的碱性条件下，按照重量体积比1:20-1:30，即蛋白浓度为20-30g/L加入包涵体溶解缓冲液，进行溶解变复性，变复性时间不超过1h。

10.根据权利要求6或者7所述的制备方法，其特征在于：所述步骤6)中所述酶切转化、分离纯化的具体方式为：步骤5)变复性后的融合蛋白经肠激酶酶解16-24h后即可得到中间体多肽、标签和连接肽的混合液，混合液使用UniSP-50XS阳离子交换分离即可获得纯度符合要求的中间体多肽样品，其中UniSP-50XS阳离子交换纯化条件为缓冲液A：5-10‰HAc，pH3.0-4.0，缓冲液B：0.5-2mol/L NaCl+5-10‰HAc，pH 4.0-6.0，缓冲液C：25-100mmol/LPB+0.5-2.0mol/L NaCl+20-30％IPA，pH 5.0-7.0。