[发明专利]一种貉裘皮制品真伪的荧光PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种荧光PCR鉴定貉裘皮制品真伪的检测方法，包括貉上游引物：NP‑F；貉下游引物：NP‑R；貉探针：NP‑P；检测方法：提取样品DNA；对样品DNA进行荧光PCR扩增；对扩增曲线分析后判定结果。通过特异性实验、灵敏度实验、重复性实验和盲测实验,结果表明，本发明特异性好、灵敏度高、效率高，克服了普通PCR检测方法的缺点，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种基于MGB探针的荧光PCR鉴定貉鞣制毛皮的检测方法，涉及分子检验鉴定技术领域。

背景技术

貉(Nyctereutes procyonoides)是重要的毛皮动物，貉皮是主要的制裘原料，其针毛较长，富有弹性，绒毛丰厚、细柔、灵活。貉皮制裘后轻暖耐用，保温性强，可制作服装、帽子、毛条、领子等。随着“毛皮平民化”趋势的出现，裘皮市场需求量十分可观。由于裘皮产品的商业利润巨大，市场上存在不少假冒、仿冒等以假乱真的现象。所以，迫切需要一种高效准确的毛皮制品检测方法。

目前常见的毛皮鉴定方法有宏观形态学法、微观形态学法和分子生物学法。由于裘皮加工工艺多样化，许多裘皮制品依据宏观特征或微观特征难以鉴别；分子生物学方法中，由于鞣制毛皮的DNA降解和片段化比较严重，普通PCR法的灵敏度差、准确率低。探针法实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是在PCR反应体系中加入化学修饰的寡聚核苷酸探针。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收不会有荧光信号被检测到。而当PCR扩增时，Taq酶的5’-3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。MGB探针是在传统Taqman探针的基础上改进，通过在探针3’端加入MGB基团，提高探针的退火温度，缩短探针的长度，提高了探针的特异性和灵敏度。

本发明建立了一种貉裘皮制品真伪的荧光PCR检测方法，利用MGB探针，能够高效、准确和快速的检测貉裘皮制品的真伪。线粒体CO I基因序列作为DNA条码已广泛地应用在分子物种鉴定中，本发明针对CO I基因设计引物和MGB探针。

发明内容

本发明的第一个目的是设计针对貉的特异性引物和探针。

本发明的第二个目的是建立快速区分貉裘皮制品的分子检测方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下方案：

1、鞣制貉毛的预处理及DNA提取

A、鞣制貉毛的预处理

取貉毛的针毛10根，平均长度约7cm。将貉毛放入2mL离心管中，使用75％乙醇浸泡5min，再用ddH₂O洗涤3次，晾干。

B、鞣制貉毛DNA的提取

将处理后的貉毛剪碎成0.2～0.5cm，置于2mL离心管中，加入280μlTNE、30μl 10％SDS、20μl蛋白酶K、20μl DTT，立即涡旋振荡1min混合均匀。瞬时离心后，将离心管至于56℃水浴中过夜消化处理。参照AXYGEN动物基因组提取试剂盒说明书进行，加入350μl蛋白去除液，涡旋振荡30s均匀混合，12000r/min离心10min。将DNA制备管置于2ml离心管中，将离心后的上清移至制备管中，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入500μl洗涤液，12000r/min离心1min。弃掉滤液，加入700μl去盐液，12000r/min离心1min。弃滤液，重复一次去盐过程。弃滤液后，空管离心1min。将DNA制备管转移到新1.5ml离心管中，加入65℃预热的Eluent洗脱液70μl洗脱、制备DNA，-20℃冷冻备用。

2、引物和探针的设计