[发明专利]用于制备生理活性多肽复合物的方法

权利要求书

1.一种用于制备生理活性多肽和非肽聚合物的缀合物的方法，其包括：

(1)使生理活性多肽与非肽聚合物在包含有机溶剂的反应溶液中反应以连接生理活性多肽与非肽聚合物，其中所述非肽聚合物在其两个末端或三个末端上具有反应基团；和

(2)从步骤(1)的反应混合物分离并纯化与非肽聚合物共价连接的生理活性多肽的所述缀合物，

其中

所述有机溶剂是选自异丙醇、乙醇和甲醇的醇；

步骤(1)中制备的所述缀合物具有低杂质含量；

所述反应溶液包括基于所述反应溶液的总体积按体积计45-55％量的所述有机溶剂、和柠檬酸钠；

所述反应溶液具有4.5至6.5的pH；并且

所述非肽聚合物是聚乙二醇。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生理活性多肽具有两个或更多个N端。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述生理活性多肽选自胰岛素、促黄体激素(LTH)、促卵泡激素(FSH)、凝血因子VIII、凝血因子VII、脂联素、抗体、抗体片段scFv、Fab、Fab'、F(ab')2和松弛素。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述生理活性多肽是胰岛素。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述胰岛素是天然胰岛素或通过在天然胰岛素或其片段的一个或多个氨基酸中的替换、添加、缺失、修饰或其组合的任何之一制备的变体或衍生物。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述非肽聚合物与所述胰岛素的β链的N-末端结合。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述非肽聚合物与所述胰岛素或胰岛素衍生物的胺基或硫醇基结合。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述非肽聚合物具有选自下列的反应基团：醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基、邻-吡啶基二硫化物、硫醇和琥珀酰亚胺衍生物。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述琥珀酰亚胺衍生物是丙酸琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基羧甲基、羟基琥珀酰亚胺基或碳酸琥珀酰亚胺酯。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述非肽聚合物在两个末端上具有作为反应基团的醛基。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述分离和纯化通过离子交换色谱实现。

12.一种用于制备生理活性多肽复合物的方法，其包括：

(1)根据权利要求1-11中任一项所述的方法制备生理活性多肽和非肽聚合物的缀合物，并且其中制备的所述缀合物具有低杂质含量；和

(2)将选自免疫球蛋白Fc区、抗体、白蛋白和转铁蛋白的载体与所述缀合物的非肽聚合物共价连接，以产生其中非肽聚合物的末端分别与所述生理活性多肽和所述载体连接的肽复合物；

其中所述非肽聚合物是聚乙二醇。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述免疫球蛋白Fc区由选自CH1、CH2、CH3和CH4结构域的1-4个结构域组成。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述免疫球蛋白Fc区进一步包括铰链区。

15.根据权利要求12所述的方法，其中所述免疫球蛋白Fc区是源自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fc区。

16.根据权利要求12所述的方法，其中所述免疫球蛋白Fc区是IgG4Fc区。

17.根据权利要求12所述的方法，其中所述免疫球蛋白Fc区是人非糖基化IgG4Fc区。