[发明专利]Alpha菌毛基因在仔猪腹泻致病性大肠杆菌监测、鉴别中的应用

说明书

本发明涉及Alpha菌毛基因在仔猪腹泻致病性大肠杆菌监测、鉴别中的应用。本发明还提供一对用于检测仔猪腹泻致病性大肠杆菌的特异性引物和试剂盒。鉴定引物用于猪场临床环境中致仔猪腹泻大肠杆菌的快速检测；对从饲料、饮水(或污水)、扬尘和粪便中分离细菌为模板，利用这对引物进行PCR扩增，如果是致仔猪腹泻致病性大肠杆菌，则PCR扩增为预期阳性；如果是其他非致病大肠杆菌，如沙门菌、魏氏梭菌等其他菌属，则结果为阴性。本发明基于不同菌属或者不同表型大肠杆菌中Alpha菌毛基因的分布差异，以及Alpha菌毛cblB基因序列保守性的特点，为临床快速区分和鉴定致仔猪腹泻大肠杆菌提供新的方法和选择。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。鉴于Alpha菌毛仅存在于致仔猪腹泻大肠杆菌及其他一些致病性大肠杆菌基因组中，因此可作为分子标记，利用其基因片段中的保守序列设计一对特异性的引物，通过常规PCR扩增特征性基因片段进行检测。

背景技术

仔猪腹泻是生猪生产中最常发的疾病，可以导致仔猪日增重减少，脱水甚至死亡，给生猪养殖业带来严重的经济损失。除了由猪传染病胃肠炎病毒(TGEV)，猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒(RDV)等病毒引起的仔猪腹泻外，产肠毒素大肠杆菌(ETEC)，沙门菌，魏氏梭菌等细菌也是引起仔猪腹泻的最常见的病原体，。其中ETEC根据其表达的菌毛类型可以进一步分类为K88+，F18+，987P+，F41+，K99+等不同血清型。目前临床上对猪场新发仔猪腹泻疾病的诊断主要是：(方法1)通过不同病原体的常规分离鉴定和进一步对利用单因子抗血清进行分离菌的玻板或者试管凝集实验以确认阳性。因此，在确定细菌病原引发的腹泻时，需要使用不同大肠杆菌K88，K99，F18，987P，F41菌毛的单因子抗血清，不同沙门菌单因子抗血清，以及魏氏梭菌鉴定方法分别进行检测，直到获得阳性反应结果，成本较高；(方法2)通过实验室对肠道、粪便样品进行划线分离、培养等常规分离鉴定，在进一步通过生化试验确定菌属后(通常培养需要一天)，再通过血清凝集或者针对不同抗原血清型的特异性引物进行PCR以确定具体病原菌血清型，过程繁琐，耗时耗力。值得注意的是，许多标准株和绝大多数临床分离株都需要筛选特殊的培养基，并且在适宜的环境下(如温度、pH值等)进行实验室的连续培养传代，其用于血清学检查的外膜抗原表达需较为充分，由于未经上述方法处理的菌株其粘附素在体外培养条件下不能达到一定程度的表达，因而采用单因子血清进行玻板或试管凝集试验检测时，往往不能产生肉眼可见的凝集反应，这就导致基于菌毛检测的玻板或试管凝集试验的应用性受到很大程度的限制。

Alpha菌毛一般又称为5类菌毛或者称类定植因子抗原I(CFA/I-like)家族。在人源ETEC上，定植因子(CFs)是非常重要的黏附素，并且至今至少发现了25种不同的CF。其中CFA/I，CS4，CS14，CS1，CS17和CS19的抗原决定簇同源性很高。CFA/I是研究最为透彻的CF之一：该菌毛由大约1000个主要亚单位CfaB组成，顶端装配一个拷贝的黏附素蛋白CfaE；其装配由伴侣蛋白CfaA和前导蛋白CfaC共同协助完成。Alpha菌毛的构成与之类似，由操纵子cblABCD转录的四个亚单位组成：CblA和CblC分别是是伴侣蛋白和前导蛋白，CblB是菌毛的主要亚单位，CblD是顶端黏附素。GenBank中现有的Alpha菌毛序列数据全部来源于全基因组测序(例如登录号CP025036.1，通过搜索基因cblA或cblB或cblC或cblD可以找到该序列，注释为全基因组软件自动注释)。但是关于大肠杆菌Alpha菌毛具体功能描述的文献还未有发表。对于该菌毛的表述仅能从关于洋葱伯克氏菌同源菌毛的文章(Umadevi S.Sajjan,Hong Xie,Matthew D.Lefebre,Miguel A.Valvanoand JanetF.Forstner.Identification and molecular analysis of cable pilusbiosynthesisgenes in Burkholderia cepacia.Microbiology(2003),149,961–971)中得到部分信息。

发明内容