[发明专利]快速检测犬埃立克体感染的引物及检测试剂和试剂盒

权利要求书

1.一种快速检测犬埃立克体感染的引物，其特征在于，其上游引物的DNA序列为<210>2，下游引物的DNA序列为<210>3。

2.一种快速检测犬埃立克体感染的试剂，其特征在于，由权利要求1所述的引物制备。

3.一种快速检测犬埃立克体感染的试剂，其特征在于，主要通过以下过程过程制备：

E.canis 16S rRNA基因的合成及其重组质粒的构建：根据下载的16S rRNA基因序列，进行16S rRNA全长基因的体外合成，并克隆至pMD-18T载体，获得重组质粒pT-16SrRNA，将含有重组质粒的重组阳性菌过夜培养后，提取质粒，

E.canis 16S RRNA基因重组质粒拷贝数的确定：将提取重组质粒pT-16SrRNA倍比稀释，浓度在1×10⁸～10⁰拷贝/μL之间，

E.canis RPA引物的设计与合成：对E.canis 16s rRNA基因进行序列比对，筛选高度保守的序列作为扩增的靶序列，设计RPA引物，并将上游引物5'端用地高辛标记，下游引物5'端用生物素标记，通过试验筛选出具有高特异性和敏感性的检测RPA引物，

RPA反应体系的配制：配制RPA反应体系，包括RPA FP和RPA RP、Rehydration Buffer、dd H₂O、模板和MgAc试剂，将所有试剂预混后，转入预添加exo冻干酶制剂的PCR反应管中，并充分混匀，将模板加入反应管中，并将MgAc加在反应管盖中，混匀，盖紧后瞬时离心，放入38-42℃水浴锅中进行RPA反应，反应时间确定为28-32min，

筛选出RPA最佳引物，以E.canis核酸为模板，分别用若干对E.canis RPA引物进行RPA扩增，随后对扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，根据特异性、敏感性和产物量筛选出RPA最佳引物，即上游引物的DNA序列为<210>2，下游引物的DNA序列为<210>3。

4.根据权利要求3所述的快速检测犬埃立克体感染的试剂，其特征在于，将所得引物质粒制成胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体IgG：采用柠檬酸三钠还原法制备平均颗粒直径为30-50nm的胶体金溶液，取胶体金溶液加入试管中，向其中加入小鼠抗地高辛单克隆抗体IgG，恒温缓慢振荡20-40min，在3-5℃下，12000-14000r/min离心30-50min，弃去上清液，沉淀溶解于0.05-0.2moL/L、pH＝7.9-8.1的Tris-HCL缓冲溶液中，得到胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体IgG。

5.根据权利要求4所述的快速检测犬埃立克体感染的试剂，其特征在于，通过胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体IgG制成RPA-LFA试纸条或试剂盒：

制备RPA-LFA试纸条：RPA-LFA试纸条包含5个部分：加样垫、结合垫、吸收垫、NC膜和PVC塑料垫，在NC膜上设置检测线和质控线，

结合垫制作：取一片NC膜，将制备的胶体金标记的小鼠抗地高辛单克隆抗体IgG均匀滴加喷到NC膜上，放在真空干燥箱中36-38℃干燥8-12min，取出后作为结合垫，在NC膜检测线上包被经PBS缓冲液稀释至1.5-2.5mg/mL的链霉亲和素，在质控线上包被1.5-2.5mg/mL的羊抗鼠IgG，室温下干燥20-40min，

组装：顺序分别为：在PVC塑料垫的中间区域先贴上NC膜，结合垫贴在NC膜的前方区域，结合垫压NC膜1.5-2.5mm，再在结合垫的前方贴上样品垫，样品垫压结合垫1.5-2.5mm，最后将吸水垫贴在NC膜的后方，吸水垫压NC膜1.5-2.5mm，将试纸板切割为条状，低温保存备用。