[发明专利]多重乙肝疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种多重乙肝疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)冻干HBsAg质粒脂质体的制备

将卵磷脂、胆固醇按3:1-5:4摩尔比，置于圆底烧瓶中，加入一定量的有机溶剂溶解，然后在37℃水浴中旋转蒸发，除去有机溶剂，形成磷脂膜；然后加入一定量的0.01-0.05MpH7.4PBS-HBsAg质粒溶液，PBS-HBsAg质粒溶液中的脂质体与HBsAg质粒的体积比为5:1-20:1，继续旋转蒸发至形成乳白色、均匀的脂质体悬液，45℃水浴6h后轻微漩涡混合1min，再用微孔滤膜过滤，得质粒脂质体样品；在质粒脂质体样品中加入抗冻剂，混合后立即在-80℃快速预冻后，再进行冷冻干燥，-20℃保存备用，经55000r/min超速冷冻离心1.5h，即得冻干质粒脂质体；

2)壳聚糖微球的制备

将步骤1)所得的冻干质粒脂质体，以及一定量的佐剂、寡肽，置于1-1.5％的海藻酸钠水溶液中，充分混合均匀，缓慢滴入到含有5-10g/L氯化钙的壳聚糖溶液中,磁力搅拌30min以上,离心弃上清液，蒸馏水洗涤数次，干燥，即得壳聚糖微球；

3)交联微球的制备

在步骤2)所得的壳聚糖微球和抗-HBs中加入一定量的交联剂戊二醛，保持40℃恒温水浴条件，充分搅拌反应，反应结束后，静置至完全分层，弃上清液，下层物质分别用异丙醇和石油醚洗涤3次以上，50℃烘干过夜，即得交联微球。

2.如权利要求1所述的多重乙肝疫苗的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述有机溶剂为氯仿或二氯甲烷。

3.如权利要求1所述的多重乙肝疫苗的制备方法，其特征在于：步骤1)中，在形成磷脂膜之后，加入PBS-HBsAg质粒溶液之前，还包括以下步骤：用与有机溶剂相同量的乙醚洗下磷脂膜，使得有机相：无机相＝3:1-5:1体积比加入PBS-HBsAg质粒溶液，轻微漩涡混合，旋转蒸发至凝胶形成并脱落。

4.如权利要求1所述的多重乙肝疫苗的制备方法，其特征在于：步骤1)中，制得的质粒脂质体样品形态圆整，其粒径为50-300nm。

5.如权利要求1所述的多重乙肝疫苗的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述抗冻剂为甘露醇、蔗糖或海藻糖。

6.如权利要求1所述的多重乙肝疫苗的制备方法，其特征在于：步骤1)中，将制得的质粒脂质体样品分为四等份，其中三份分别加入甘露醇、蔗糖、海藻糖，混合后立即在-80℃快速预冻后，再进行冷冻干燥，-20℃保存备用，另一份4℃保存备用，然后分别取上述四个样品经超速冷冻离心。

7.如权利要求1所述的多重乙肝疫苗的制备方法，其特征在于：步骤1)中，将卵磷脂、胆固醇置于圆底烧瓶中时，还同时置入有十八胺，所述卵磷脂、胆固醇、十八胺的摩尔比为5:4:1。

8.如权利要求1所述的多重乙肝疫苗的制备方法，其特征在于：步骤2)中，所述佐剂为PLGA或PELA。

9.一种根据权利要求1至8中任一项所述的制备方法得到的多重乙肝疫苗。