[发明专利]一种γδT细胞的培养方法

说明书

本发明提供了一种γδT细胞的培养方法，包括如下步骤：(1)从外周血中获得单个核细胞，用额外添加有抗体的无血清培养基重悬后，调整单个核细胞密度，培养箱培养；(2)第4天和第8天，分别补加不添加抗体的无血清培养基；第12天，扩增培养结束；(3)对T细胞筛选，将分选后的γδT细胞转移至细胞培养瓶，补加γδT细胞培养基；(4)第4天和第8天，分别补加γδT细胞培养基；第12天，扩增培养结束；(5)收集γδT细胞。本发明的优点为：提供了一种专门针对γδT细胞的细胞培养方法，扩增γδT细胞12天，扩增倍数达到60倍，培养出的γδT细胞对K562肿瘤细胞的杀伤活性在25:1时达到90％以上。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种γδT细胞的培养方法。

背景技术

近年来，随着细胞分子生物学和基因工程改造等技术的飞速发展，细胞免疫治疗已成为继手术、化疗和放疗三大常规治疗之后的第四种肿瘤治疗的新模式。通过大量的基础生物学研究和临床实验等安全性、有效性数据结果显示，基因修饰化免疫细胞治疗(CAR-T/TCR-T)方法明显优于T细胞过继免疫治疗和树突状细胞(DC细胞)免疫治疗。

CAR-T疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy)，嵌合抗原受体T细胞疗法，在治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤上有显著的效果。它的基本原理是通过分离获得病人自体的T细胞，通过基因工程改造编辑T细胞，使T细胞表达相关肿瘤抗原特异性的scFV抗体片段的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。通过与肿瘤细胞表面特异性的抗原受体结合，激活T细胞后释放大量细胞因子、肿瘤杀伤因子等清除肿瘤细胞。

按T细胞表面受体(TCR)的不同，T细胞可分为αβT细胞和γδT细胞，其中，αβT细胞占T细胞总数的95％以上，γδT细胞则至占T细胞总数的2-5％，且主要分布于黏膜相关淋巴组织中。在过去研究中，人们对γδT细胞的功能及认知有限，但随着生物技术的快速发展，γδT细胞的生理功能和作用机制却被不断发现。研究发现，γδT细胞所具备的非MHC限制杀伤肿瘤细胞的特征使之可以成为一种理想的细胞制剂原料，可以在无抗原呈递细胞(APC细胞)的作用下，直接启动对肿瘤细胞的杀伤，并且对有免疫逃逸倾向低表达MHC分子的肿瘤细胞，也具备良好的杀伤效果。

然而，目前却并没有一种专门针对γδT细胞而设的细胞培养方法，将具有普遍广泛性的T细胞培养方法用于γδT细胞的培养明显不具备针对性，且十分不利于γδT细胞的扩增以及对肿瘤细胞的杀伤活性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种专门针对γδT细胞而设的γδT细胞的培养方法。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

一种γδT细胞的培养方法，包括如下步骤：

(1)外周血单个核细胞的制备

从150-250mL外周血中分离获得单个核细胞，用添加有anti-CD3 antibody与anti-CD28 antibody的无血清培养基充分重悬后，调整单个核细胞密度为(2-3)x10⁶细胞/mL，再将装有上述培养液的细胞培养瓶于培养箱中培养3天；

(2)T细胞的扩增培养

第4天，向细胞培养瓶中补加50-100mL不添加抗体的无血清培养基；

第8天，向细胞培养瓶中补加100-200mL不添加抗体的无血清培养基；

第12天，T细胞扩增培养结束；

(3)γδT细胞的筛选