[发明专利]一株高产1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌工程菌及发酵方法

说明书

本发明提供了一株高产1‑脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌工程菌及发酵方法，其保藏号为CCTCC NO.M2017849，命名为解淀粉芽孢杆菌HZ‑15，并进一步提供了解淀粉芽孢杆菌HZ‑15的构建方法及高产DNJ的方法。采用分子生物学技术，在之前实验室保存的产DNJ解淀粉芽孢杆菌LX‑12的基础上，通过同源重组方法成功构建了高产DNJ的工程菌HZ‑15。该菌株以黄豆为原料进行固体发酵，通过在固体发酵培养基中添加1%的麦芽浸粉和2%的乳糖，DNJ产量高达1117.2mg/kg。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高产1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌工程菌及发酵方法。

背景技术：

随着糖尿病患者的日益增加，寻找治疗糖尿病的药物已成为医学领域的一大难题。1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin)简称DNJ，是一种哌啶类多羟基生物碱，其化学结构与葡萄糖类似，具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，可以竞争性结合α-糖苷酶活性部位，当消化道中或糖蛋白加工过程中的糖苷酶被DNJ等多羟基生物碱竞争性抑制时，会出现糖类吸收障碍和糖蛋白寡糖链的合成异常等现象，从而具有抑制血糖升高、抗肿瘤、抗病毒等一些生物学活性。DNJ的来源很广泛，可通过植物、动物和微生物产生，因微生物具有生长繁殖快，易培养，且可通过菌种改良，发酵工艺优化的方法来提高产量等优点，近年来利用微生物合成DNJ已成为研究热点。已经发现的可以合成DNJ的微生物主要有芽孢杆菌和链霉菌。

微生物中DNJ的合成途径相关研究表明，在芽孢杆菌中，葡萄糖通过异构化为果糖，之后经氨化、脱磷酸、氧化生成一种氨基糖，氨基糖经异构化生成甘露伊霉素(MJ)和野尻霉素(NJ)，最终还原生成了DNJ。转氨酶、肌醇磷酸酶和氧化还原酶分别由基因gabT1、yktC1和gutB1编码，是DNJ合成途径中的关键酶，这三个基因在解淀粉芽孢杆菌基因组上连在一起，形成调控DNJ合成的操纵子。然而在DNJ合成过程中，调控DNJ合成的关键酶不仅上述三种催化反应酶，还包括催化MJ转化为NJ的异构酶等，而尚未有研究者查找到相关的调控基因。目前通过菌株改造的方法来提高DNJ产量的研究相对较少。

目前，已有野生菌发酵用于DNJ的生产，例如枯草芽孢杆菌B2利用豆渣进行发酵生产DNJ；解淀粉芽孢杆菌140N以可溶性淀粉为碳源发酵，其DNJ产量达到0.8g/L；但上述发酵的产量依然不理想，通过生物技术手段获得一株产量高的工程菌，一直是本领域技术人员努力的目标。

发明内容：

本发明提供一株可以高产1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌HZ-15，该菌株于2017年12月28日保存于湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2017849。

本发明的另一个目的在于提供了一种解淀粉芽孢杆菌HZ-15高产1-脱氧野尻霉素的发酵方法，本发明提供的发酵方法包括固体发酵和液体发酵，两种发酵方式均可获得高浓度的目的产物。

本发明的最后一个目的在于提供了解淀粉芽孢杆菌工程菌HZ-15在制备DNJ中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一株可以高产1-脱氧野尻霉素的解淀粉芽孢杆菌工程菌HZ-15，所述的菌株通过下述方式构建得到：