[发明专利]一种用于减小数字聚合酶链式反应中由光学假象引起的量化误差的方法

说明书

本发明涉及一种用于减小数字聚合酶链式反应(dPCR)中由光学假象引起的量化误差的方法及一种用于以dPCR确定样品中感兴趣核酸的量或浓度的方法。

发明领域

本发明涉及一种用于减小数字聚合酶链式反应(dPCR)中由光学假象引起的量化误差的方法及一种用于以dPCR确定样品中感兴趣核酸的量或浓度的方法。

发明背景

对于许多生物学，生物化学，诊断或治疗目的，必须准确和精确测定样品中核酸的量或浓度。dPCR是一种较新的核酸检测和量化办法，为用于核酸绝对量化和罕见等位基因检测的常规实时定量PCR提供备选方法。dPCR如下起作用，即将核酸的样品分配入许多单独的，平行的PCR反应；这些反应中的有些含有(阳性的)而有些不含(阴性的)靶分子。在PCR分析后，使用阴性反应的分数来生成该样品中靶分子的数目的绝对计数。dPCR胜过实时PCR的关键优势之一是它卓越的量化准确度。这种优势依赖于dPCR的内在特性，因为量化仅仅需要阳性分区的正确计数和理论分配体积的知识(计数数目对PCR效率并非非常灵敏)。不需要量化标准。这消除由标准自身引起的潜在量化误差。

现有技术提供方法用于在基于小滴的测定法中鉴定不正确的阳性或阴性计数及校准或标准化信号(US 2013/0302792 A1)。这种标准化应当改善阳性和阴性计数之间的分离。因此，标准化减小假阳性或阴性计数的风险。最终目标是通过校正为核酸获得的信号来改善核酸浓度测定的准确度和精确度。

然而，现有技术的方法没有考虑PCR中由于光学测定受到假象损害的情形所致的量化误差。

因而，需要减小由光学假象引起的量化误差的，通过dPCR量化感兴趣核酸的方法。本发明的目标是提供那些方法。

通过基于数字聚合酶链式反应(dPCR)的方法解决了该问题，其中分析每个反应区域中光学信号的分布并自感兴趣核酸的量或浓度的计算排除具有光学假象的反应区域。

发明概述

因而，本发明提供一种高度准确和精确的通过dPCR量化核酸的方法，其容许更加精确和准确地测定样品中感兴趣核酸的量或浓度。特别是，上述方法容许排除例如由于反应区域中的杂质(例如污垢)或任选测量中的技术失败而具有光学假象的反应区域。

发明详述

在第一个方面，本发明涉及一种用于减小数字聚合酶链式反应(dPCR)中由光学假象引起的量化误差的方法，其中在反应区域的阵列中量化感兴趣核酸的量或浓度，该方法包括

a)提供dPCR中使用的反应区域的阵列；

b)测定每个反应区域中光学信号的分布；

c)如果步骤b)中测定的反应区域中的光学信号在该反应区域中不均匀分

布的话，将该反应区域鉴定为无效；并

d)自该感兴趣核酸的量或浓度的计算消除鉴定为无效的反应区域。

如上文详述地，可靠测定核酸的量或浓度的方法在数个产业应用中，例如在医药领域中特别重要。对于数个方面，可能不仅必须澄清样品中是否存在核酸，而且可能需要–尽可能精确和准确地–测定样品，例如自患者或产品获得的样品中核酸的量或浓度。例如在疾病严重程度的诊断中或在环境技术或产品的质量控制中，例如为了限定污染或杂质，这可能是感兴趣的。

本dPCR方法聚焦于确定预定体积中存在的核酸数目且不考虑光学假象。