[发明专利]一种合成基因及其构建烟草多基因定点突变载体的方法与应用

说明书

本发明公开了一种合成基因及其构建烟草多基因定点突变载体的方法与应用，所述合成基因的序列是以tRNA+sgRNA+gRNA的核苷酸序列顺序合成的一个或多个基因重复序列。合成的基因连接进pUC57‑Kan大肠杆菌克隆载体中。有两种方法扩增获得合成基因序列。构建好的载体转化烟草，通过测序挑选出成功敲除多基因的转基因烟草植株。本发明适用于在一株转基因烟草中同时造成多个目的基因定点突变及应用，为研究烟草中多个基因之间的相互作用提供一种快速、简便的方法。

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种合成基因及其构建烟草多基因定点突变载体的方法与应用。

背景技术

多基因突变体在植物基础功能研究及作物育种中有着重要意义。传统获得多突变体的方法是通过单突变体间的相互杂交、子代分离来完成。但是此方法存在以下问题：1、基因突变的位点随机性，并不能都能得到所需基因位点的单突变体；2、通过杂交重组得到多突变体，若几个基因间存在紧密连锁，则几乎无法获得多突变体；3、整个过程耗时耗力。

CRISPR-Cas9是编辑基因组简单、高效且应用广泛的工具。该系统主要利用内切酶Cas9及定位的向导gRNA(sgRNA)分子，对基因组中特定的DNA序列进行精细改造，在特定的位置敲除或者插入基因。在植物中，获得稳定的多突变体植株需要用转基因技术将Cas9及多个gRNA功能元件导入来发挥功能。因此，如何将多个gRNA元件（包含sgRNA）及Cas9序列整合在一个双元载体上，是植物中实现多基因同时敲除的关键。这里有个难点，如何保证串联在载体上的多个gRNA元件在体内表达的时候，能够被体内的系统进行正确的分解成单个的gRNA在生物体内，DNA分子上的tRNA基因经过转录生成tRNA前体，然后被精确加工成成熟的tRNA。所以我们利用这个体系，在体外设计tRNA+gRNA+tRNA的合成基因，这个基因一旦转化到植物体内，可以被体内的RNA内切酶识别，将合成基因的前体切成tRNA和gRNA。利用这个体系可以保证多个gRNA在大量表达的同时也能够正确的被分割。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种合成基因；第二目的在于提供所述的合成基因构建烟草多基因定点突变载体的方法；第三目的在于提供所述的合成基因的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述合成基因的序列是以tRNA + sgRNA +gRNA 的核苷酸序列顺序合成的一个或多个基因重复序列。

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

A、通过合成基因构建CRISPR/Cas9载体：根据基因序列设计多个靶位点sgRNA_1-n序列，合成Bsa I +（tRNA + sgRNA_1-（n-1）+ gRNA）+tRNA + sgRNA_n + Bsa I基因序列；

B、合成后的基因序列连接进无Bsa I酶切位点的pUC57-Kan大肠杆菌克隆载体上；

C、PCR扩增合成基因片段：根据合成基因插入pUC57-Kan大肠杆菌克隆载体位置，利用通用引物M13和高保真酶以pUC57-Kan质粒为模板扩增合成基因片段；

D、Bsa I酶切电泳切胶回收合成基因；

E、Bsa I酶切电泳切胶回收pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体；

F、通过T4连接酶将合成基因与pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体连接起来。

本发明的第三目的是这样实现的，所述的合成基因在构建烟草多基因定点突变载体并转化烟草植株同时获得多个目的基因定点突变中的应用。