[发明专利]一种改良的小鼠胰岛细胞富集方法

说明书

本发明公开了一种改良的小鼠胰岛细胞富集方法。首先将已分离提取的胰岛培养6～48小时后，离心弃上清后用培养液重悬，过滤重悬液，滤渣即为富集的胰岛细胞；再将富集的胰岛组织注射入“U”形管，利用连通器原理使胰岛组织聚集于“U”形管。利用该方法富集小鼠胰岛，可显著提高操作成功率和产率，并保持胰岛细胞活性，还可有效节约时间；该方法是一种更加简单快捷、廉价高效的小鼠胰岛细胞富集方法，在小鼠胰岛移植模型构建、新药实验、内分泌学基础研究等领域具有实际的应用价值，具有很好的推广应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种改良的小鼠胰岛细胞富集方法。

背景技术

目前器官移植是治疗各类终末期疾病的最佳手段之一，但移植术后的排斥反应仍是影响患者术后长期生存的最重要原因，针对该领域的仍需开展大量研究。在移植免疫的研究中，合适的动物模型是必不可少的；目前常用的用于移植免疫研究的动物模型包括皮肤移植、心脏移植、胰岛移植等，其中小鼠胰岛移植因其操作相对简单、价格低廉、观察指标确切等优点，而成为目前最广泛应用的移植免疫模型。

小鼠胰岛移植方法包括原位移植和异位移植，其中以异位移植多见。异位移植又包括皮下、血液、肝脏和肾包膜下，其中以后两者为多。目前小鼠胰岛移植的手术操作已基本成熟，移植手术本身成功率已有保证。但是，传统的小鼠胰岛移植技术中仍存在一些亟待解决的问题，包括：1.胰岛分离难度较大，穿刺失败率高，得率较低；2.胰岛提纯操作繁琐，提取纯度低；3，胰岛分散且不均一，富集困难；4.胰岛活力及功能不一致，移植操作难以保证实验操作的一致性，易出现统计学误差等。其中问题1.及问题2.已有一些解决方案报道（如专利201510886141.2），但其他问题，尤其是小鼠胰岛富集这一关键问题的解决方案则尚未见报道。在小鼠胰岛富集领域存在的问题极大的制约了小鼠胰岛移植技术的推广及应用，亟待解决。

同时，近年来除了移植免疫研究领域，在新药实验、内分泌学基础研究等领域中富集的小鼠胰岛细胞亦成为研究所需的必须品。对小鼠胰岛细胞的富集方法的改良研究亦可对这些领域产生重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有小鼠胰岛细胞富集方法的缺陷和不足，提供一种可有效节约时间、提高操作成功率和产率，并保持胰岛细胞活性的小鼠胰岛细胞改良富集方法。

本发明的目的是提供一种改良的小鼠胰岛细胞富集方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种改良的小鼠胰岛细胞富集方法，首先将已分离提取的胰岛培养6～48小时后，离心弃上清后用培养液重悬，过滤重悬液，滤渣即为富集的胰岛细胞；再将富集的胰岛组织注射入“U”形管，利用连通器原理使胰岛组织聚集于“U”形管。

优选地，所述改良的小鼠胰岛细胞富集方法包括如下步骤：

（1）胰岛细胞的富集：将已分离提取的胰岛使用含10～20%胎牛血清的RMPI1640在36℃～38℃培养6～48小时，离心弃上清，沉淀用RMPI1640重悬，以0.05～0.2mm网孔的过滤件过滤重悬液，滤渣即为富集的胰岛细胞；

（2）富集胰岛细胞的收集：用微量移液工具收集步骤（1）富集的包膜完整的胰岛组织，沿“U”形管一端以5～15μl/s的速度缓慢注射入“U”形管，利用连通器原理使胰岛组织聚集于“U”形管。

其中，优选地，步骤（1）中，还需将滤渣转移至装有RMPI1640的培养容器中，此时肉眼可见白色点状物聚集于培养容器，将培养容器沿顺时针方向、以20～100cm半径、5～30圈/每分钟的速度水平旋转培养容器使白色点状物富集，即得到富集的胰岛细胞。

优选地，步骤（1）中，已分离提取的胰岛使用含15%胎牛血清的RMPI1640在37℃培养24小时。

优选地，步骤（1）中离心的条件是600～1200rpm、4～25℃离心1～2min。