[发明专利]传代细胞源ND、IB、AI三联灭活疫苗的制备方法及其应用

说明书

本发明提供了一种传代细胞源鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法及其应用，包括步骤如下：取EB66细胞于生物反应器中进行生长培养，用于病毒接种；采用二阶培养法，向EB66细胞接种新城疫病毒、传染性支气管炎病毒或禽流感病毒；在接毒24h后，病毒EID₅₀达到最高时收获病毒并保存，得到病毒液；重复上述步骤以分别获得新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液并灭活；将灭活后的新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液混合，制备灭活疫苗。本发明采用EB66传代细胞系进行鸡新城疫病毒、传染性支气管炎和禽流感病毒的培养，避免了使用鸡胚造成胚体异源蛋白和外源病毒污染的风险，提高病毒的生产品质，简化病毒的生产工艺。

技术领域

本发明涉及一种ND(鸡新城疫)、IB(传染性支气管炎)、AI(禽流感H9亚型)三联灭活疫苗的制备方法及其应用，特别是涉及一种采用全悬浮培养工艺和传代细胞源对鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感H9亚型三联灭活疫苗进行生产的方法，属于兽用生物制品技术领域。

背景技术

鸡新城疫、传染性支气管炎和禽流感作为影响养禽业的三大传染病，每年导致大量养殖鸡的死亡，对我国养禽业的发展造成重大损失。现有对此三种疫病的防控多采用疫苗免疫的方式来达到良好的防控效果，而目前的疫苗主要为病毒灭活疫苗，以鸡胚作为病毒培养基质进行病毒的培养扩繁。但由于鸡胚的尿囊液中含有大量动物源蛋白，在提取病毒时易被带入病毒液中，导致成品疫苗中有大量动物源蛋白，从而引起过敏反应等副作用。此外，鸡胚中还易引入其它外源病毒，导致疫苗受到污染，影响疫苗使用安全。

已有报道采用传代细胞系Vero细胞系、BHK-21细胞系来培养鸡传染性支气管炎病毒，使用传代细胞系包括MDCK细胞系来培养禽流感病毒，但都因培养后的病毒滴度过低或无法实现大规模全悬浮培养而不能进行大批量生产，无法真正取代传统的鸡胚接种培养法。此外，目前在生产细胞源多联苗时，必须使用多种细胞来对不同病毒进行培养，导致生产工艺复杂，病毒生产品质差异较大，很难保证各生产批次的稳定性，严重限制了细胞源多联苗的生产，特别是鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的生产。

发明内容

本发明提供了一种传代细胞源鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法及其应用，以至少解决现有技术中三联灭活疫苗需采用多种细胞进行培养、工艺复杂、批次不稳定的问题。

本发明提供了一种传代细胞源鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感三联灭活疫苗的制备方法及其应用包括步骤如下：

步骤1：取EB66细胞于生物反应器中进行生长培养，当EB66细胞密度达到6×10⁶cells/mL-15×10⁶cells/mL时，用于病毒的接种；所述EB66细胞的培养温度为35℃-37℃，培养转速为130rpm-150rpm；

步骤2：采用二阶培养法，向EB66细胞接种传染性支气管炎病毒、新城疫病毒或禽流感病毒，所述病毒的接毒量为0.0001MOI-1MOI，细胞接毒后33℃-35℃的培养温度下以110rpm-140rpm的培养转速进行吸附，吸附0.5h-2h；

步骤3：在接毒24h后，每隔12h取样测定病毒的EID50，在病毒EID50达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的病毒液；

步骤4：重复步骤1-3以分别获得新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液，将收获的新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液分别进行灭活；

步骤5：将灭活后的新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒液混合，并制备灭活疫苗。

进一步地，步骤1所用EB66细胞培养方法如下：