[发明专利]一种内生真菌高效遗传体系的构建方法及其应用

说明书

本发明提供一种内生真菌高效遗传体系的构建方法，包括(1)适用于齿梗孢霉的农杆菌转化法；(2)齿梗孢霉体内高表达系统；(3)齿梗孢霉体内荧光表达系统；(4)齿梗孢霉基因定向敲除系统。所述内生菌为齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)。本发明所提供的内生真菌齿梗孢霉遗传体系，首次建立了齿梗孢霉体内高表达系统，筛选出四个与齿梗孢霉适配的强启动子。本发明可在激活隐性基因簇、化合物生物合成机制以及酶功能研究中的应用。本发明方法设计合理，与现有原生质体转化法相比，其成本低廉、操作简单、实验周期短、转化效率高，为齿梗孢霉的基因工程研究和遗传改造提供材料。

技术领域

本发明属于生物领域的遗传方法，涉及一种内生真菌的遗传操作体系，尤其涉及一种高效遗传体系的构建方法及其应用。

背景技术

丝状真菌是天然产物的重要来源，齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)是蘑菇内生丝状真菌，能生产线粒体F0F1-ATP合成酶抑制剂aurovertin系列化合物，包括aurovertin E，B(1)，D(2)等。研究发现，aurovertin B具有良好的抗乳腺癌活性，有望成为临床治疗乳腺癌的备选药物。aurovertins含有独特的2,6-二氧杂双环辛烷结构，该结构独特的生物合成途径已被解析。前期测序结果发现，齿梗孢霉中含68个天然产物生物合成基因簇，具有巨大的开发价值。然而，齿梗孢霉是一种非模式的内生丝状真菌，之前研究仅建立了基于原生质体转化的基因敲除体系，该方法操作周期长，成本高，步骤繁琐，限制了对其进一步的研究开发。

丝状真菌遗传操作体系主要有原生质体转化法、电激转化法、醋酸锂转化法、农杆菌介导转化法、以及CRISPR-Cas9等。前三种方法因需制备原生质体实验周期长、成本高。尽管CRISPR-Cas9已成功运用于少数模式真菌，但农杆菌转化法凭其优越性仍是最主流的丝状真菌遗传操作方法。其基本原理是，农杆菌通过毒力因子将肿瘤诱发(Ti)质粒上的转移DNA(T-DNA)整合到宿主染色体上，造成宿主的突变。它具有以下优点：(1)受体材料广泛；(2)转化效率高；(3)单拷贝转化比例高；(4)非同源的T-DNA转化可导致随机突变,同源的T-DNA转化时发生定向突变。此前齿梗孢霉未建立基于农杆菌介导的高效遗传体系。

发明内容

本发明的目的是提供一种内生真菌高效遗传体系的构建方法，是一种新的齿梗孢霉遗传体系，该体系能对齿梗孢霉进行高效遗传改造。

本发明所提供的一种内生真菌高效遗传体系的构建方法，所述内生菌为齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula，ATCC46034，购自每个ATCC)通过以下步骤实现：(1)农杆菌转化方法；(2)齿梗孢霉高表达系统的建立；(3)齿梗孢霉体内荧光表达系统；(4)定向基因敲除系统的建立。

其中步骤(1)农杆菌转化方法主要包括如下步骤：(a)重组农杆菌菌液制备；(b)真菌孢子悬浮液制备；(c)农杆菌与真菌孢子共培养；(d)转化子培养；(e)转化子筛选。

(a)重组农杆菌菌液制备：将重组质粒电转化入根癌农杆菌EHA105，涂布于含50μg/mL卡那霉素LB固体培养基上，单菌落长出后进行PCR鉴定，将正确的重组农杆菌扩大培养并收集菌体，用含400μM乙酰丁香酮(AS)的液体诱导培养基(IM)重悬菌体至OD₆₀₀约0.1，继续培养至OD₆₀₀达到约0.8；其中重组农杆菌Agrobacterium tumefaciens EHA105，购自上海唯地生物技术有限公司。

(b)真菌孢子悬浮液制备：用含1‰吐温20的无菌水冲洗马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)真菌菌丝，过滤收集分生孢子，用IM稀释孢子浓度至10⁷个/mL；

(c)农杆菌与真菌孢子共培养：取步骤(a)100μL农杆菌菌液与步骤(b)100μL真菌孢子悬浮液混合均匀，涂布于含400μM铺有玻璃纸的固体IM表面，25℃培养48h；