[发明专利]一种猪血抗菌肽的提取方法

说明书

本发明公开了一种猪血抗菌肽的提取方法，其具体步骤为：向新鲜猪血中加入六偏磷酸钠水溶液，搅拌均匀，离心后弃沉淀，调节上清液的pH值，即得抗凝猪血；向抗凝猪血中加入Alcalase酶和胰蛋白酶，微波酶解，酶解结束后调节pH，加热至沸腾，过滤，滤液即为酶解液；将酶解液超滤，纳滤，获得抗菌肽粗提液；将抗菌肽粗提液进行凝胶层析，上样后用双蒸水洗脱，收集抗菌活性较高的组分，冷冻干燥即得猪血抗菌肽。有益效果为：本发明提取方法简单可行，提取效率、得率和纯度高，制得的抗菌肽活性高、可快速杀灭细菌、有广谱的抗菌特性。

技术领域

本发明涉及生物提取技术领域，特别涉及一种猪血抗菌肽的提取方法。

背景技术

自从抗生素被发现后，由于它具有良好的抑菌效果被广泛地应用于医疗、传统兽药和饲料添加剂中，但是也由于抗生素的过度使用，致病菌的耐药性和药物残留等问题越来越严重，逐渐引起了人们的重视，寻找抗生素的有效替代品，解决耐药性及药物残留问题，迫在眉睫。而抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）是一种原核生物及真核生物均能产生的、分布广泛且种类繁多的、具有广谱抗菌活性的多肽类物质，它对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、原生动物、癌细胞、病毒等均有明显的抑制作用，被视为具有极大应用前景的抗生素替代品，成为了国内外的研究热点。抗菌肽最早是瑞典科学家Boman等在一种名叫惜古比天蚕（Hyalophora cecropia）的昆虫体内诱导并分离纯化得到的，并将其命名为天蚕素（Cecropins）。到目前为止，人们纷纷从各种原核及真核生物当中鉴定出并分离得到1700多种抗菌肽类物质。

抗菌肽的种类繁多，分布也十分广泛，随着对抗菌肽的研究深入，抗菌肽的类别也越来越清晰。目前，抗菌肽一般根据以下几个方面进行分类：根据抗菌肽的合成途径将抗菌肽分为非核糖体合成抗菌肽（non-ribosomally synthesized peptides）和核糖体合成抗菌肽（ribosomally synthesized peptides）两类。根据抗菌肽的结构分为：（1）含α-螺旋的线性抗菌肽；（2）富含某些氨基酸残基的抗菌肽；（3）含1个二硫键的抗菌肽；（4）具有β-折叠结构的抗菌肽；（5）由已知多肽衍生的具有抗菌活性的肽[31]。根据抗菌肽的来源分为：（1）细菌抗菌肽，如多粘菌素、杆菌肽等；（2）昆虫抗菌肽，如天蚕素、昆虫防御素等；（3）植物源抗菌肽，如植物防御素、凤仙花素等；（4）蛙类动物抗菌肽，如蛙皮肽；（5）水生动物抗菌肽，包括鱼类、贝类、甲壳动物类抗菌肽，种类繁多复杂；（6）哺乳动物抗菌肽，主要有防御素（Defensins）、富组蛋白（Histatins）和Cathelicidins三种。目前国内外研究中与猪源抗菌肽相关的主要是猪小肠中的抗菌肽，而在猪血中提取、纯化抗菌肽并研究其抗菌活性的研究却很少。因为猪血中起到主要作用的免疫细胞的白细胞，而其中中性粒细胞约占猪血中白细胞总量的70%，所以从猪血液中提取、纯化抗菌肽是可行的。

现有技术如授权公告号为CN103989707B的中国发明专利，公开了一种猪血有限酶解提取后分离得到的猪血抑菌剂，同时还提供了该抑菌剂的制备工艺，上述猪血抑菌剂是经有限酶解后再通过超滤及纳滤手段得到的分子量为500~3000的小肽混合物，F值为14.5，等电点pI值为4.4~9.7，混合物中酸性氨基酸占25.6%，碱性氨基酸占10.3%，卟啉及卟啉的水解物含量小于千分之一，具有很强的抑菌活性；提取的猪血抑菌剂是天然资源中得到的产物，具有良好的杀菌抑菌能力，不同于一般化学成分的杀菌抑菌产品，不会对生物体的组织、皮肤产生副作用，有着安全可靠，价格低廉，制备相对简单的优点。为制备抑菌杀菌药物及日常皮肤清洁用品方面提供了新的选择。但是该猪血抑菌剂酶解前未经抗凝处理，酶解效率低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提取方法简单可行，提取效率、得率和纯度高，制得的抗菌肽活性高、可快速杀灭细菌、有广谱的抗菌特性的猪血抗菌肽的提取方法。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：