[发明专利]一种原野库蠓的特异基因及其分子鉴定方法

权利要求书

1.一种原野库蠓特异基因，其特征在于，所述基因为COI基因，其具有如SEQ ID No.1所示的序列。

2.权利要求1所述的库蠓的COI基因的PCR引物。

3.权利要求2所述的库蠓的COI基因的PCR引物，其特征在于，优选的，PCR引物序列分别为：

正向引物5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’

反向引物5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。

4.一种原野库蠓的分子鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.1 从待测的库蠓组织中分离提取DNA；

4.2 以该DNA为模板，对COI基因采用的引物为：

正向引物5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’，

反向引物5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出原野库蠓COI基因；

4.3 取适量步骤4.2扩增后的COI基因产物用琼脂糖电泳分离，经溴乙锭染色后在凝胶成像系统下观察，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性扩增出大小约为677bp的条带，测序；

4.4 根据测序结果，如果相应COI基因序列与SEQID No.1的相似性在98％以上，即可判断所述的待测昆虫组织为原野库蠓。

5.一种原野库蠓的分子鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.1.标本的采集与保存

现场采用灯诱法，晚挂晨收进行诱集，采获得标本经冷冻处死后直接保存于95％酒精中；

5.2.DNA模板的制备

采用小型昆虫微量DNA模板制备方法提取原野库蠓DNA，提取的DNA样品保存于-20℃备用；

5.3.目的基因序列的获取

引物合成：以获得的未知库蠓DNA为模板，合成引物，所用引物序列如下：

正向引物5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’

反向引物5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’

PCR扩增：PCR反应50μL体系如下：模板5μL、正向引物和反向引物混合2.5μL、2×PCRMaster Mix 25μL、ddH2O 17.5μL；PCR产物保存于4℃备用；

5.4 PCR扩增产物检测与基因序列测定

取5μLPCR扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳，150V电压，75mA电流，30min；溴乙锭染色，凝胶成像系统检测，如果特异性扩增出大小约为677bp的产物，测序，结果显示与基因序列SEQ ID No.1的相似性为99.9％，则可判定为原野库蠓。