[发明专利]适用于近红外二区荧光活体成像的共聚焦显微系统

说明书

本发明公开了一种适用于近红外二区荧光活体成像的共聚焦显微系统。本发明为光学电动显微镜安装了共聚焦扫描单元并引入了760‑900nm的近红外激光作为激发光源（如：793nm半导体激光器），激发生物标本中的荧光探针得到近红外二区的荧光信号，然后该荧光信号由光纤引出，并由对近红外二区（1000‑1700nm）光响应灵敏的光电倍增管（PMT）接收，实现对标本的探测、扫描和成像。本发明光路简单，可灵活装卸，便于改装，用途多样，相较于商用LSCM系统，其使用和维护成本更低。

技术领域

本发明属于应用光学的显微生物成像领域，是在普通商用电动显微镜的基础上，添加共聚焦扫描单元，并以波长位于760-900nm的半导体激光器作为光源，搭建的一台适用于近红外二区荧光活体成像的激光扫描共聚焦显微系统。

背景技术

激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope简称LSCM）是光学显微镜、激光光源、扫描单元、光电探测器、数据采集单元和计算机单元相结合的新型高精度显微成像系统。它在研究和分析活细胞结构，分子、离子的实时动态变化过程，组织和细胞的光学连续切片和三维结构重建等方面的作用，是传统的光学显微镜所望尘莫及的。

LSCM采用单色激光作为光源,并附设小孔光阑——针孔(pinhole)，针孔与物面共轭，于是在物面上构造了聚焦于单个像素点的点光源，与光学显微镜的场光源相比，共聚焦显微镜的点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及可平面偏振激发等独特的优点。LSCM除了在照明光源前有一个针孔(pinhole)外，在检测器前方也有一个针孔。光源针孔、物面上的某一像素点和检测针孔，三者相对于整个显微镜系统是两两共轭的，也就是物面上点光源激发出的光信号通过一系列的透镜最终可同时聚焦于光源针孔和检测针孔，也就是所谓的“共聚焦”。这样只有物面上点光源处激发出的光才可以通过探测器前面的针孔，而点光源空间以外激发出的光（被视为杂散光）都被挡在探测针孔以外而不能被探测器接收，从而实现了针对物面上某一特定的像素点（也就是点光源所聚焦的位置）的探测。振镜单元可以使激光按等时间间隔向X,Y两个方向偏转特定的角度，从而实现对样品的逐点扫描，其实质就是不断改变物面上点光源的位置，依次点亮不同的像素点，所以在不同时刻，通过检测针孔的光信号来自物面上不同的像素点，这些光信号由检测针孔后的光电探测器接收后，转变为电信号传输至计算机，成像软件根据不同时刻接收到的电信号区分不同像素点的光强，最终在屏幕上呈现为清晰的整幅物平面的二维图像。

此外，在轴向（垂直于物平面的方向），点光源可通过垂直移动物镜或载物台的位置聚焦于样品的不同深度。综上，点光源可通过对样品进行左右、上下的扫描来获得厚标本(可达400μm)不同层面的图像，亦可对细胞、组织厚片或活体样本进行类似CT断层扫描的无损伤性连续光学切片(optical sectioning)。连续光学切片经计算机三维重建的处理，能够从任意角度观察标本的三维剖面或整体结构。由此可见，扫描和检测装置是LSCM的重要组成部分，台阶扫描和光束扫描(或振镜扫描)是目前广泛应用的两类扫描装置，而检测器主要有光电倍增管(PMT)和雪崩二极管(APD)。在一台LSCM中，光源照射的方向、强度、时间,各种方式的扫描，光学器件如滤光片轮转换，检测器参数的调节，共聚焦针孔孔径大小的转换以及检测信号的放大、采集、转换、处理直至成像、输出等一系列复杂工作，都由计算机协调控制和完成。

由于LSCM能随时采集和记录检测信号，因此它能对活细胞进行实时动态检测。但是，传统的LSCM，基于可见光的激发和可见光的荧光发射。可见光的波长短，因此它们在生物组织中的散射较大，进而带来了光损耗大和激发光斑聚焦难这两个问题。因此，传统的LSCM探测深度都不大，只能观察细胞、薄的组织等生物样品，在活体成像中的应用非常少。

近红外二区一般是指1000-1700nm波段，波长位于近红外二区的光在生物组织中的散射较小，因此基于近红外二区的荧光生物成像具有成像深度大、空间分辨率高的优势。此外，生物组织在近红外二区波段的自发荧光相对较小，从而可以提高成像的信噪比。