[发明专利]一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌溶血素Hlych

权利要求书

1.一种具有免疫保护作用的美人鱼发光杆菌溶血素Hly_ch蛋白在开发美人鱼发光杆菌基因工程亚单位疫苗中应用，其特征在于，所述亚单位疫苗的制备方法包括如下步骤：

1）重组载体pMD18T-hly_ch的构建

提取所述美人鱼发光杆菌的基因组DNA，所述美人鱼发光杆菌的菌种保藏编号为MCCC1K03226，以基因组DNA为模板，以Hly_ch-F，Hly_ch-R为引物扩增去除信号肽编码序列的hly_ch基因，所述hly_ch基因序列为SEQ ID NO：3；采用降落PCR扩增hly_ch基因全长，所述引物Hly_ch-F、Hly_ch-R的序列如下：

Hly_ch-F：5’-GCGGATCCGACGTTATATCAATATTAAGCAG-3’；带有BamHI酶切位点；SEQ ID NO：10；

Hly_ch-R：5’-GCGTCGACTTACTGATTTATGGTTGATGGGTC-S’；带有SalI酶切位点；SEQ ID NO：11；

将获得的所述hly_ch基因与T载体连接，获得重组载体pMD18T-hly_ch，并对所述重组载体pMD18T-hly_ch进行测序，进行蛋白质亚细胞定位；

2）重组表达载体pET32a-hly_ch的构建

使用限制性内切酶BamH I和Sal I分别对所述重组载体pMD18T-hly_ch和表达载体pET32a（+）进行双酶切，凝胶电泳回收酶切产物，按比例混合，22-25℃连接2-3h，转化大肠杆菌感受态细胞中，接入LB平板一中，37℃培养过夜；挑取单菌落摇菌，使用载体通用引物进行PCR鉴定；将阳性菌落扩大培养，保存菌种并提取质粒pET32a-hly_ch；

3）hly_ch基因的原核表达

将所述质粒pET32a-hly_ch转化表达菌株BL21中，涂布到LB平板二中，37℃培养过夜；挑取所述LB平板二的单菌落摇菌过夜，次日将菌液接种到液体LB培养基中，220r/min摇菌，至OD₆₀₀值达为0.6-0.8，加入IPTG诱导表达4-6h；

4）Hly_ch蛋白亚单位疫苗的制备

诱导Hly_ch蛋白表达后利用超声裂解菌体，离心，利用QIAGEN Ni-NTA柱对蛋白纯化，获得目的蛋白；将Hly_ch蛋白用弗氏完全佐剂乳化，获得亚单位疫苗；

其中所述感受态细胞为DH5α，所述LB平板一与所述LB平板二为含有氨芐青霉素的固体LB平板，所述氨芐青霉素的浓度为45-55μg/L；

步骤3）中所述液体LB为含有氨芐青霉素的液体LB，所述氨芐青霉素的浓度为45-55μg/L，所述IPTG的浓度为1mM。