[发明专利]一种VB12完全抗原的制备方法

说明书

本发明公开了一种维生素B12(VB12)完全抗原的制备方法,解决了现有维生素B12是小分子结构，无法激发免疫宿主动物产生抗体的问题，由于VB12分子结构中不具有与常规载体蛋白(BSA,KLH等)反应的活性基团，技术方案中包括保留VB12主体结构的前提下，通过添加一个合适大小的连接分子，分子末端为具有与载体蛋白HOOC‑反应的活性基团H2N‑，再通过EDC偶联反应将VB12分子连接到载体蛋白上，得到符合要求的目的完全抗原，本发明方法能生产出高产率的完全抗原，具有方法简单新颖，成本低，等优点，适用于VB12抗体的生产及免疫学检测。

技术领域

本发明属于免疫学技术领域，具体的是说一种维生素B12（以下简 称VB12）完全抗原的制备方法。

技术背景

维生素B12又称钴胺素或氰钴素。是一种由含钴的卟啉类化合物组成的B族维生素。VB12是一种含有3价钴的多环系化合物，4个还原的吡咯环连在一起变成为1个咕啉大环（与卟啉相似），是维生素B12分子的核心。所以含这种环的化合物都被成为类咕啉。

其在人体中的生物功能有1促进红细胞的发育和成熟，使肌体造血机能处于正常状态，预防恶性贫血；维护神经系统健康2以辅酶的形式存在，可以增加叶酸的利用率，促进碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢；3具有活化氨基酸的作用和促进核酸的生物合成，可促进蛋白质的合成，它对婴幼儿的生长发育有重要作用。4代谢脂肪酸，使脂肪、碳水化合物、蛋白质被身体适当运用；5消除烦躁不安，集中注意力，增强记忆及平衡感6是神经系统功能健全不可缺少的维生素，参与神经组织中一种脂蛋白的形成。缺乏VB12的症状有1恶性贫血（红血球不足）；2月经不顺；3眼睛及皮肤发黄，皮肤出现局部（很小）红肿（不疼不痒）并伴随蜕皮；4恶心，食欲不振，体重减轻；5唇、舌及牙龈发白，牙龈出血；6头痛，记忆力减退，痴呆；7脊髓变性，神经和周围神经退化；8舌、口腔、消化道的粘膜发炎；9若出现食欲不振、消化不良、舌头发炎、失去味觉等症状；10小孩缺乏维生素B12的早期表现为精神情绪异常、表情呆滞、少哭少闹、反应迟钝、爱睡觉等症状，最后会引起贫血。

研究表明，血清维生素B12的浓度低于70pmol/L ，即可诊断为维生素B12 缺乏（正常值为70～590 pmol/L ）。目前VB12的测定方法主要有：微生物法：最早使用的方法，检测周期长，重现性差，无法达到快速准确检测VB12的目的。荧光反应法：仪器普遍，灵敏度高，但衍化转化过程会有干扰物质，需要对样品进行处理。化学发光检测法：仪器特殊，较难推广。高效液相色谱法：仪器昂贵，成本高。

VB12的免疫学检测方法不仅方法简便，成本低廉，不需要高精密的仪器，而且检测的灵敏度都不亚于高效液相色谱法；但建立高效免疫学检 测方法的关键是需要高品质的抗体，高品质抗体的前提是制备免疫原 型较强的完全抗原，而众所周知，VB12是小分子结构，激发不了动物机体产生抗体，因此，研究人员需要提供一种简单可靠的方法 ，以获得一种能够高效激发动物机体产生抗体的完全抗原。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种制备方法简单、生产周期短，产率高，生产成本低的用于VB12的免疫学检测方法的免疫原型强的完全抗原。

技术方案包括下述步骤：

（1）30℃下将1g VB12溶于12ml二甲基亚砜（DMSO）溶液中后，随后将260mg N,N'-羰基二咪唑（CDI）加入到上述溶液中搅拌25分钟左右；

（2）将2.7mmol 二胺烷烃类（1,6二氨基己烷或1,4二氨基丁烷）一次加入步骤（1）反应溶液中，室温下搅拌24h，反应示意图见附图1；

（3）将步骤（2）制备的溶液倒入30ml乙酸乙酯中，将瓶子竖立起来；

（4）步骤（3）混合溶液中上层清液缓慢倒出，余下残夜置于50ml丙酮中超声处理5分钟；