[发明专利]一种测定血清中总甲状腺激素的方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种测定血清中总甲状腺激素的方法及试剂盒，先从血清中提取总甲状腺激素，对血清中的总甲状腺激素进行SPTPP衍生化，然后再利用超高效液相色谱‑串联质谱(UPLC‑MS/MS)进行检测。与传统方法相比，本发明仅利用10μL血清样品，即可高效精准检测血清总甲状腺激素浓度，灵敏度极高、抗干扰能力强，可最大程度保证样品的有效回收与高重复性。

技术领域

本发明属于生物化学检测领域，涉及一种测定血清中总甲状腺激素的方法及试剂盒，尤其涉及少量血清精准检测甲状腺激素T4、T3、rT3的测定方法及试剂盒。

背景技术

甲状腺激素对人和动物的生长、发育、新陈代谢和神经发育等具有重要的作用。血清中甲状腺T3、T4、rT3的测定可提供甲状腺激素水平的重要信息，为甲状腺功能紊乱的病因诊断及毒性因子识别提供帮助。目前，免疫分析法被广泛应用在甲状腺激素T3、T4的测定，但该方法的特异性不强、方法灵敏性不高。此外，使用免疫分析方法检测怀孕女性血清的甲状腺激素T4和T3时，由于怀孕期间类固醇激素和甲状腺结合球蛋白的复杂变化，导致甲状腺激素水平检测错误。

目前，已有研究者通过HPLC-MS/MS直接测定血清的甲状腺激素水平，该方法与免疫分析法相比，对甲状腺激素的鉴定的可信度与重现性均有所提高，但仍存在检出限较高，导致测定所需的血清量达500μL的缺点。

发明内容

为达到少量血清精准快速检测甲状腺激素水平的目的，本发明提供了一种测定血清中总甲状腺激素的方法及试剂盒，先对从血清中提取的总甲状腺激素进行SPTPP衍生化，然后再利用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)进行检测，采用少量(10μl)血清即可精准测定其中甲状腺激素T4、T3、rT3，该方法弥补了传统分析方法不稳定、重现性差的缺陷。该方法重现性好，血清使用量少，且用于测定微量血清中的总甲状腺激素含量时亦更加准确。

本发明采取的技术方案为：

一种测定血清中总甲状腺激素的方法，包括：首先提取待测血清中的总甲状腺激素，然后将总甲状腺激素提取液进行SPTPP((5-N-succinimidoxy-5-oxopentyl)-triphenylphosphonium bromide)衍生化，再对SPTPP衍生化产物进行UPLC-MS/MS检测，完成对血清总甲状腺激素的测定。

进一步地，所述总甲状腺激素包括结合态甲状腺激素和游离态甲状腺激素，通过沉淀待测血清中的甲状腺激素结合蛋白，即可释放出结合态甲状腺激素。

进一步地，所述总甲状腺激素包括甲状腺激素T4、T3或者甲状腺激素T4、T3和rT3。

通过以下方法提取待测血清中的总甲状腺激素：10-50μl待测血清加入等体积的甲醇内标溶液和1-5μl抗氧化剂，混匀置于-20-0℃环境下，15分钟后取出；大于8000g离心力，离心5-15分钟，取上清液即得总甲状腺激素提取液。

优选地，所述抗氧化剂为柠檬酸、抗坏血酸和二硫苏糖醇的混合水溶液，混合水溶液中各物质浓度均为50g/L；所述甲醇内标溶液为甲状腺激素¹³C₆-T4浓度为3ng/mL的甲醇内标溶液。

进一步地，所述SPTPP衍生化包括：向300μl衍生反应缓冲溶液中加入10-20μl总甲状腺激素提取液，加入50μl衍生试剂，密封涡旋混匀，40℃衍生化反应10分钟，反应结束后立刻将其(即前述衍生化反应的产物)置于冰上同时加入衍生反应终止溶液700μl终止反应。

优选地，所述衍生试剂为10mM SPTPP的甲醇溶液；所述衍生反应缓冲溶液为0.1M的磷酸缓冲液(PBS、pH 8.0)；所述衍生反应终止溶液为含有0.1％甲酸的乙腈：水＝1:3溶液。