[发明专利]一种人恶性胶质瘤细胞SCID鼠大脑移植瘤模型的构建方法

说明书

本发明公开了一种人恶性胶质瘤细胞SCID鼠大脑移植瘤模型的构建方法，包括以下步骤：制备原代恶性胶质瘤细胞；选取雄性SCID鼠，分为5组：①脑内接种原代恶性胶质瘤细胞；②脑内接种原代恶性胶质瘤细胞胞并感染HCMV；③脑内接种原代恶性胶质瘤细胞感染HCMV并用USP18高表达腺病毒载体处理组；④脑内接种原代恶性胶质瘤细胞感染HCMV并用干扰腺病毒载体USP18小干扰腺病毒载体USP18处理组；⑤正常对照组；确定靶点，无菌接种单细胞悬液；终止实验时，断头取脑，鉴定人恶性胶质瘤细胞SCID鼠大脑移植瘤模型是否构建成功。本发明的瘤模型更能体现HCMV感染人胶质瘤的实际感染状态。

技术领域

本发明属于动物模型的构建技术领域，具体地说，涉及一种人恶性胶质瘤细胞SCID鼠大脑移植瘤模型的构建方法。

背景技术

已有研究发现，HCMV的基因表达产物在恶性胶质瘤中表达显著增高，且与肿瘤恶性程度呈正相关。恶性胶质瘤对手术、放疗、化疗均不敏感，亟需寻求靶向的治疗方法。HCMV感染细胞通过NF-КB、TBK1-IRF3I型干扰素通路参与抗病毒及抗肿瘤作用，多种泛素特异性蛋白酶作用于该通路的不同靶点进行负向调控。在前期研究中，我们发现HCMV感染星形胶质细胞6小时，基因表达水平变化大于10倍的分子全部是干扰素刺激基因，其中负性调节基因只有泛素特异性蛋白酶USP18。通过临床标本检测发现，HCMV即刻早期、早期和晚期基因表达产物及USP18在恶性胶质瘤呈高表达。

由于CMV感染具有严格的细胞嗜性和种属特异性，缺乏合适的动物模型进行体内实验，至今为止，HCMV感染与恶性胶质瘤发生和发展的关系机制不明。有报道利用鼠CMV感染的胶质瘤细胞建立体内感染模型1，但是鼠CMV与HCMV的基因组和感染模式均有差别，因此实验结果仅具参考价值。

发明内容

有鉴于此，本发明针对目前缺乏与天然感染模式相近的HCMV感染人胶质瘤动物模型的问题，提供了一种人恶性胶质瘤细胞SCID鼠大脑移植瘤模型的构建方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种人恶性胶质瘤细胞SCID鼠大脑移植瘤模型的构建方法，包括以下步骤：

步骤1、复苏液氮罐冻存的恶性胶质瘤细胞，在培养箱中培养过夜，然后加入Hoechst33342标记原代恶性胶质瘤细胞，继续培养48h后收集细胞，制备得到原代恶性胶质瘤细胞；

步骤2、选取雄性SCID鼠，体重210-110g，分为5组：①脑内接种原代恶性胶质瘤细胞；②脑内接种原代恶性胶质瘤细胞胞并感染HCMV；③脑内接种原代恶性胶质瘤细胞感染HCMV并用USP18高表达腺病毒载体处理组；④脑内接种原代恶性胶质瘤细胞感染HCMV并用干扰腺病毒载体USP18小干扰腺病毒载体USP18处理组；⑤正常对照组，每组10只；

步骤3、参考Batker法确定靶点，在SCID鼠双眼连线后3mm，冠状缝前1mm，中线旁开1mm颅骨处用圆头牙科钻钻一小孔，孔径1.2mm，深达硬脑膜表面而不伤及脑组织，无菌接种1*10⁸/mL10μL单细胞悬液，速率为0.2μL/min；终止实验时，断头取脑；

步骤4、用HE染色观察病理形态学，鉴定人恶性胶质瘤细胞SCID鼠大脑移植瘤模型是否构建成功。

进一步地，所述培养箱的条件为：温度为37℃，5％CO₂氛围，用10％高糖DMEM/F12(Hyclone)进行培养恶性胶质瘤细胞U87。

进一步地，步骤4中用HE染色观察病理形态学，鉴定人恶性胶质瘤细胞SCID鼠大脑移植瘤模型是否构建成功具体为：如果①②③④组结果显示细胞生长活跃，密集成群，排列紊乱，异型性明显，病理性核分裂相多见，证明大量HCMV感染的恶性胶质瘤细胞的生长，⑤组细胞分布均匀，无胶质瘤细胞的异常生长；TUNEL染色检测细胞凋亡，如果①②③④组的细胞凋亡异常，为恶性肿瘤细胞，⑤组细胞为正常凋亡的细胞；鉴定动物模型建立成功。