[发明专利]一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC

说明书

本发明公开了一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC在亚单位疫苗中的应用，利用原核表达方法制备得到该重组蛋白，具体包括：PCR扩增fliC基因；构建pMD18‑T‑fliC载体，对fliC基因进行序列测定；测序结果正确的菌株扩大培养，提取质粒，获得纯化目的基因；构建重组表达载体pET‑32a‑fliC；将重组表达载体转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆，提取质粒，测序；进行重组蛋白的原核表达；利用SDS‑PAGE分析重组蛋白表达情况；对重组蛋白进行Western blot验证。本发明通过原核表达方法获得大量纯化的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC的重组蛋白，并进一步利用动物实验评估该重组蛋白的免疫原性和对于模型动物的保护力，表明迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC能够用于研制亚单位疫苗。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体地说，涉及一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC。

背景技术

迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda，E.tarda)在水产养殖上危害严重，鱼类感染该菌后死亡率高、易反复、免疫力低下，传统抗生素和化学药物疗效不确切，急需开发新型、高效、安全的防治方法。疫苗使用在畜禽生产上的巨大成功给水产养殖提供诸多借鉴，多种水产疫苗被开发应用，展现良好前景，遗憾的是，目前尚无商品化疫苗用于防控迟缓爱德华菌感染。除此之外，迟缓爱德华菌可以引起人的多种类型感染，近年来人通过食源途径感染的报道不断增多，揭示了本菌的公共卫生学价值。

鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要结构蛋白之一，在细菌运动、粘附和侵染宿主过程中发挥重要作用，是细菌的重要毒力因子。研究发现，细菌鞭毛蛋白能够活化宿主免疫反应，起到疫苗佐剂的作用，进一步研究发现，鞭毛蛋白可以通过TLR5通路诱导炎症反应发生并促使树突状细胞成熟。该蛋白无论是与抗原混合还是融合表达，均表现出良好的免疫效果。除此之外，鞭毛蛋白本身具有较强的免疫原性，具有一定的免疫保护力。FliC是构成鞭毛丝的主要蛋白成分，是目前鞭毛研究的焦点蛋白，其生物学功能得到一定程度解析。本发明通过原核表达方法获得大量纯化的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC的重组蛋白，并进一步利用动物实验评估该重组蛋白的免疫原性和对于模型动物的保护力，表明迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC能够用于研制亚单位疫苗。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC，具体通过原核表达方法，获得迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC重组蛋白，从而进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC在亚单位疫苗中的应用。

进一步，所述的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌鞭毛蛋白FliC的制备方法，具体步骤如下：

(1)以迟缓爱德华菌ET-CL基因组序列为模板，P1和P2为引物，PCR扩增fliC基因；PCR扩增的反应体系共20μL，其中2×Taq PCR Mix 10μL，模板1μL，引物P1(20μM)和P2(20μM)各1μL，ddH₂O 7μL；PCR扩增的反应程序为94℃预变性5min，94℃30s，54℃30s，72℃60s，25个循环，72℃10min；其中引物P1和P2为：

P1：5’-ATGGCACAAGTAATTAATACC-3’；SEQ ID NO：1；

P2：5’-ACGCAGCAGAGACAGGACG-3’；SEQ ID NO：2；

(2)构建pMD18-T-fliC载体，对fliC基因进行序列测定；