[发明专利]一种用于检测柯萨奇病毒A组6型中和抗体的方法及其所应用的重组病毒

权利要求书

1.一种假病毒，其特征在于，由重组表达子质粒pEGFP-CV-A6-capsid表达的柯萨奇病毒A组6型结构蛋白和重组复制子质粒pCV-A16-replicon在T7聚合酶作用下得到的柯萨奇病毒A组16型亚基因组RNA组装而成；所述重组表达子质粒pEGFP-CV-A6-capsid的氨基酸序列为SEQ ID No.1；所述重组复制子质粒pCV-A16-replicon的核苷酸序列为SEQ ID NO：3；

所述重组表达子质粒pEGFP-CV-A6-capsid使用绿色荧光蛋白报告基因，氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列；所述重组复制子质粒pCV-A16-replicon的报告基因为萤火虫荧光素酶报告基因；

所述重组表达子质粒pEGFP-CV-A6-capsid SEQ ID NO：2第1位到717位为绿色荧光蛋白的编码基因；第718位到732位为肠道病毒的2A蛋白酶的识别位点；第733位到3339位为CV-A6所有结构蛋白的编码基因；所述重组复制子质粒pCV-A16-replicon SEQ ID NO：3第1位到745位为CV-A16的5’UTR核苷酸序列；第746位到2395位为萤火虫荧光素酶基因的核苷酸序列；第2396位到2410位为2A蛋白酶的识别位点；第2411位到6549位为CV-A16非结构蛋白的编码基因。

2.一种权利要求1所述假病毒的构建方法，其特征在于，所述重组表达子质粒pEGFP-CV-A6-capsid包含以下步骤：1)将绿色荧光蛋白的基因序列与CV-A6所有结构蛋白的基因序列拼接；2)并将2A蛋白酶的酶切位点插入绿色荧光蛋白基因的C末端；3)设计引物；所述引物序列为：

IF-pcDNA6-GFP-F:

ACCCAAGCTGGCTAGCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCG

IF-pcDNA6-CA6-VP1-R:

GGTGATGATGACCGGTTTAAGATGTTCTTTGTGGGCTTG

OL-GFP-AITTL-VP4-R:

CTTGGGCGCCAAGGGTAGTAATGGCCTTGTAC

OL-AITTL-CA6-VP4-F:

GGCCATTACTACCCTTGGCGCCCAAGTTTCAAC

所述重组复制子质粒pCV-A16-replicon包含以下步骤：1)用萤火虫荧光素酶的基因序列替换CV-A16所有结构蛋白的基因序列；2)并将2A蛋白酶的酶切位点插入萤火虫荧光素酶基因的C末端；3)将T7promoter序列引入至5’UTR前端；4)设计引物；所述引物序列为：

IF-NotI-T7-CA16-F:

TCAAGAATTGCGGCCGCGTAATACGACTCACTATAGGTTAAAACAGCCTGTGGGTTG

OL-CA16-5’UTR-luc-R:

CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCATTTCTTACAGTTAAGGAGCAATATATAATTAAG

FL-luc-F：ATGGAAGACGCCAAAAAC

FL-luc-R：CAATTTGGACTTTCCGCC

OL-CA16-luc-KITTL-2A-F:

GGGCGGAAAGTCCAAATTGAAGATCACAACATTGGGAAAG

IF-SalI-EV-dT25-R:

CATGAGAATTGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT。

3.权利要求1所述的假病毒在制备体外检测柯萨奇病毒A组6型和抗体的制剂的应用。