[发明专利]栽培茄SmHQT基因核心片段及其RNAi表达载体和应用

说明书

本发明公开了栽培茄SmHQT基因核心片段、含其的RNAi表达载体及其构建和应用，栽培茄SmHQT基因核心片段如SEQ ID No.3所示。本发明通过沉默SmHQT基因培育绿原酸合成减少的栽培茄品种，达到减轻栽培茄果肉褐化的目的，新的栽培品种具有良好的市场前景和经济价值。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及栽培茄SmHQT基因和利用该基因构建的RNAi载体及其应用，还涉及该RNAi载体的构建方法。

背景技术

栽培茄(Solanum melongenaL.)在我国蔬菜市场中占据重要的地位，栽培茄作为经济效益突出的蔬菜，果实的色泽和营养物质含量是决定其商品价值的关键因素，而在果肉中富集合成的绿原酸遇氧被氧化成醌类物质是导致果肉褐化的关键性因素，这些因素严重阻碍了栽培茄营养品质的改良和后期加工。

作为茄科植物中重要的苯丙素类物质，绿原酸在植物中存在广泛的积累，在果实中含量最高(绿原酸含量可占果实多酚含量的70％-90％)。由于绿原酸暴露在空气中极易氧化变为棕褐色的醌类物质，因而产生褐化的现象。而这种褐色物质严重影响了栽培茄的商品价值和后期加工。因此果肉中过多含量的绿原酸是影响栽培茄品质改良的重要因素。

绿原酸在细胞质中从苯丙氨酸经一系列的酶促反应而合成，但是合成途径非常庞杂，控制茄子绿原酸合成的关键酶，现有技术中并不明确。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供栽培茄SmHQT基因核心片段，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明的目的之二在于提供含有SmHQT基因核心片段的重组载体，如为所述SmHQT基因核心片段的RNAi表达载体。

所述RNAi表达载体可以以pBin19载体为骨架载体，在多克隆酶切位点处插入顺序连接的CaMV35S启动子、栽培茄SmHQT基因核心片段的反向序列、PDK内含子、栽培茄SmHQT基因核心片段的反向序列和Nos终止子表达框而构建成。

本发明的目的之三在于提供含有所述RNAi表达载体的微生物转化体，其可以农杆菌为受体而转化得到。农杆菌可为LBA4404。

本发明的目的之四在于提供所述的栽培茄SmHQT基因核心片段、其RNAi表达载体，或所述的微生物转化体，用于下述至少一种用途：

1)降低栽培茄中SmHQT基因的表达水平；

2)降低栽培茄中绿原酸的合成量；

3)降低栽培茄果肉在有氧环境中的褐化程度和/或褐化速度。

或者说，本发明提供了培育SmHQT基因表达水平低、绿原酸合成量低、和/或果肉在有氧环境中褐化程度低的栽培茄的方法，包括，使用所述的栽培茄SmHQT基因核心片段、其RNAi表达载体，或所述的微生物转化体。

所述表达水平或合成量的降低，可表现在栽培茄嫩叶、成熟叶和果实中的至少一处。

本发明目的之五在于提供所述RNAi表达载体的制备方法，包括如下步骤：

a.以含SEQ ID No.3的重组质粒为模板，以SEQ ID No.2和SEQ ID No.1为引物进行PCR扩增，将扩增产物纯化后用HindIII和Xba I双酶切，再与经同样双酶切的pHBLD载体连接，获得重组质粒pHBLD-SmHQT；

b.按步骤a的方法进行PCR扩增或者直接使用步骤a所得PCR扩增产物，将扩增产物纯化后用Kpn I和Xho I双酶切，再与经同样双酶切的重组质粒pHBLD-SmHQT连接，获得重组质粒pHBLD-SmHQTi；

c.将步骤b所得重组质粒pHBLD-SmHQTi用Sac I和Spe I双酶切，再与经Sac I和Xba I双酶切的pBin19载体连接，得RNAi表达载体。