[发明专利]一种利用荧光比率进行外泌体快速定量的方法

说明书

一种利用荧光比率进行外泌体快速定量的方法，其属于荧光检测的技术领域。该方法涉及到两种荧光染料，染料A是一种高度水溶性并且对膜结构没有亲和性的染料，作为实验过程中的内参。染料B是一种特异性免洗的膜染料，染料B可以与亲脂性的膜结构结合后会表现出强烈的发光性质,而在没有与亲脂性的膜结构结合的水环境中由于其疏水性而发生聚集而无荧光。本发明提供一种外泌体快速定量的方法，基于两种荧光染料的比率定量，成功实现了生物样品中外泌体的测定。该方法具有效率高，成本低，操作方便，测定结果准确性高等优点。有望在外泌体相关研究中得到广泛的应用。该方法应用于细胞培养基、唾液、血清、尿液、乳液。

技术领域

本发明具体涉及一种利用荧光比率进行外泌体快速定量的方法，其属于荧光检测的技术领域。

背景技术

外泌体是细胞经过“内吞-融合-外排”过程而形成的细胞外小囊泡。直径为30～150nm的脂质双分子层结构囊泡。它作为一种重要的细胞间信息传递分子及遗传物质传递载体，外泌体内含有多种蛋白质和RNA等物质，广泛分布于人体血液、尿液、唾液等体液中以及肿瘤细胞培养液中。肿瘤细胞分泌的外泌体可以促进肿瘤血管生成，也可以通过调控肿瘤微环境来影响肿瘤的生长与转移，外泌体在肿瘤的发展中发挥重要作用。在外泌体相关研究中，对分离纯化的外泌体进行快速准确定量显的非常重要。

目前对外泌体定量的方法主要有通过测外泌体总蛋白含量来定量外泌体的BCA蛋白定量法和借助纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)进行外泌体定量以及借助于外泌体膜上的标志性蛋白如CD63,CD9类四跨膜蛋白进行的蛋白免疫定量。外泌体的BCA蛋白定量法首先需要把分离纯化的外泌体进行裂解，让外泌体内含有的全部蛋白以及膜上的蛋白释放出来，二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和BCA工作液相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA工作液螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该复合物在560nm显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，根据吸光值可以推算出蛋白浓度，从而得出外泌体的量。现阶段分离纯化外泌体的方法，主要有超速离心以及各种商业化试剂盒，得到的外泌体残留有蛋白质，尤其利用商业化试剂盒分离的外泌体残留更多的蛋白，用此方法定量的外泌体的量不太准确。纳米颗粒跟踪分析(NTA)定量法是利用纳米颗粒跟踪分析技术可以实时地对悬浮液中的颗粒进行逐个的直接成像和观察，并用视频摄像机捕获所产生的散射光。通过跟踪单个颗粒在二维平面上的位置变化来确定颗粒的扩散情况。纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)可提供高分辨率的粒度分布图表和粒子浓度信息。该定量方法的缺点是设备比较昂贵，实验室通用性比较低。外泌体免疫定量方法主要包括蛋白免疫印迹(WB)，流式细胞法(FACS)以及商业化ELISA试剂盒。这种定量方法存在实验操作繁琐，实验仪器昂贵等问题。并且常用的外泌体标志性蛋白相对含量在不同类型的外泌体中有所不同，所以外泌体的免疫定量法结果也不够准确。综上所述，快捷，准确，高效的外泌体定量方法有待开发。本专利中细胞培养基、唾液、血清、尿液、乳液等生物样本中外泌体的分离纯化采用超速离心的方法参考文献报道(Nature，2015,523(7559),177-182)。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种借助于荧光比率进行外泌体快速定量的方法，此方法具有高效，准确度高，成本低和易操作等特点。

本发明采用的技术方案为：一种利用荧光比率进行外泌体快速定量的方法，包括以下步骤：

(1)配制染料母液

将染料A配制成100-200μM的DMSO的母液，将染料B配制成1-2mM的DMSO的母液；所述染料A为A-1、A-2或A-3，染料B为B-1、B-2、B-3、B-4、B-5、B-6或B-7；

所述染料A和染料B的结构如下：

染料A：

染料B：