[发明专利]一种海水鱼体表微生物基因组DNA提取方法

说明书

一种海水鱼体表微生物基因组DNA提取方法，属于生物技术领域，它包括以下步骤：海水鱼体表微生物样品的获取、体表样品的预处理、体表微生物的裂解、体表微生物DNA的游离、沉淀与收集。本发明技术方案通过优化海水鱼体表微生物菌群样品的取样方案、建立高效的体表微生物样品富集和高效裂解方法、高效屏蔽高浓度杂蛋白干扰，实现了海水鱼类体表微生物基因组DNA的高效提取。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说是一种海水鱼体表微生物基因组DNA提取方法。

背景技术

由于生存环境特殊，鱼类体表层覆盖着由外胚层球状细胞分泌的粘液层。而水体作为适宜的传播媒介，生存着数量和种类丰富的微生物。科学研究表明，在长期的生态交互作用下，鱼类体表细菌、真菌等微生物与粘液层形成了相对稳定的微生态环境，成为抵御病原微生物入侵的天然屏障，愈来愈多的研究表明，体表菌群主动参与了宿主免疫和代谢过程，甚至影响到宿主的行为选择。

鱼类体表微生物的研究长期聚焦于特定病原菌的分离、鉴定、侵染机制以及粘液对特定病原菌的粘附和杀灭机理方面，对体表常规微生物的关注较少。迄今为止，主要应用传统的分离培养法，研究人员对大西洋鲑、虹鳟、鲻鱼、牙鳕、鲬鱼等海水鱼类体表可培养细菌的数量和种类进行了鉴定，分离得到约15类菌属。然而，上述研究仅局限于能够被培养的体表微生物，远不能满足我们对鱼类体表微生态环境认知的需求。

与传统分离培养方法和分子鉴定技术相比，以新一代高通量测序技术为基础的16S/18S rDNA和宏基因组学(Metagenomics)研究，能够获得更全面的数据，可加深人类对各种复杂环境条件下微生物群落的构成、功能以及与环境之间互作关系的认知。开展上述工作的前提是获取高质量的基因组DNA，现阶段粪便、水环境、土壤等细菌总DNA提取方法较为成熟，且有商业化试剂盒。然而由于海水鱼类特殊的生存环境，其体表覆盖着大量粘液层，理化成分复杂，大量微生物定植或被吸附于其中，形成了一个特殊的微生态环境。应用传统的粪便、土壤、水环境等细菌总DNA提取方法或商业化试剂盒，提取海水鱼类体表微生物基因组DNA效果差，效率低，甚至难以提取。因此，为推动鱼类体表微生物生理生态学研究和应用技术的开发，亟需建立一种海水鱼类体表微生物基因组DNA提取方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种海水鱼体表微生物基因组DNA提取方法。所述方法能够提取高质量的海水鱼体表微生物基因组DNA，以满足高通量测序技术为基础的16S/18S rDNA和宏基因组学研究。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种海水鱼体表微生物基因组DNA提取方法，包括以下步骤：海水鱼体表微生物样品的获取、体表样品的预处理、体表微生物的裂解、体表微生物DNA的游离、沉淀与收集。

进一步，所述海水鱼体表微生物样品的获取：用无菌生理盐水冲洗鱼体表2-3次，利用硬质塑料薄板于体表脊椎两侧且避开胸鳍扰动区，远离粪便污染区刮取鱼体表粘液混合物，快速放入盛有蒸馏水的离心管中，再用吸管吸取1-2ml生理盐水喷洒至体表刮擦处，进行再次体表粘液混合物刮取，重复3-4次，每支离心管中鱼体表粘液混合物体积为原蒸馏水体积的10％-20％，随后将离心管缓慢震荡混匀30-40分钟。

进一步，所述海水鱼体表样品的预处理：获取的体表粘液样品需冻融2-3次，冷冻干燥，随后8000g离心15-20分钟，收集样品。

进一步，所述海水鱼体表微生物的裂解：预处理后的样品于液氮中研磨，后加裂解液、蛋白酶K和SDS溶液，涡旋混匀5-8分钟，70℃恒温水浴4分钟，涡旋混匀30s，70℃恒温水浴4分钟，涡旋混匀10s，再次70℃恒温水浴4分钟，涡旋混匀10s。